阻斷ELISA 在小反芻獸疫抗體監(jiān)測的應(yīng)用

洛松西熱，王玉恒，吉哈利，于子淇，胡劍武，旦增卓瑪

（1.西藏自治區(qū)獸醫(yī)生物藥品制造廠 850000；2. 西藏自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳獸醫(yī)局 850000；3.西藏蓮莖生物科技有限公司 850000）

小反芻獸疫（Peste des petis ruminants,PPR）是由小反芻獸疫病毒（Peste des petis ruminants virus,PPRV）引起的一種小反芻獸類的急性、接觸性傳染病[1]，主要以發(fā)熱、壞死性口炎、胃腸炎和支氣管肺炎為特征，該傳染病的發(fā)病率和死亡率較高[2-4]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定發(fā)生該疫情必須上報，我國已將該病列入一類動物疫病。因此對小反芻獸疫疫病的防控尤為重要。抗體監(jiān)測是防控重要的措施之一，可以直接反映出易感動物體內(nèi)抗體水平，保護易感動物的成功率。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELSIA）是抗體監(jiān)測的主要方法，但ELSIA 試劑盒的質(zhì)量直接影響著抗體監(jiān)測的準確性。因此本試驗選用阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒對免疫羊血清進行抗體監(jiān)測，為基層實驗室抗體監(jiān)測提供幫助。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

采集于西藏自治區(qū)獸醫(yī)生物藥品制造廠，經(jīng)小反芻獸疫活疫苗免疫的20 頭2～3 月齡的西藏本地山羊。頸靜脈采全血10mL，4℃1000r/min，5min 分離血清，-20℃保存。

1.2 儀器與試劑

酶標分析儀采購于北京普朗新技術(shù)有限公司，型號：DNM-9602；恒溫培養(yǎng)箱采購于上海鴻都科技有限公司，型號：SHP-300；高速冷凍離心機采購于湖南星科科學(xué)儀器有限公司，型號：TGL16，其他耗材均為國產(chǎn)。

小反芻獸疫阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒采購于青島立見生物科技有限公司，批號20172107。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品稀釋與加樣

用樣品稀釋液將待檢血清按1∶2 稀釋，將包被板樣品孔加入25μL 血清樣品，再加入25μL 樣品稀釋液。陰性、陽性標準血清不需要稀釋，在陰性、陽性對照孔內(nèi)各加入50μL 陰性、陽性標準血清。酶標對照孔設(shè)立2 孔，各加入50μL 樣品稀釋液。封膜，震蕩混勻，37℃孵育60min。

1.3.2 包被板洗滌

用蒸餾水按1∶20 稀釋洗滌液。孵育結(jié)束，棄掉孔內(nèi)液體。每孔加入300μL 洗滌液，洗滌4 次，棄液，在吸水紙上拍干。

1.3.3 酶標反應(yīng)

每孔加入50μL酶標抗體，封板，37℃孵育30 min。按照1.3.2包被板洗滌4 次，棄液，在吸水紙上拍干。

1.3.4 顯色與終止反應(yīng)

每孔加入50μL 底物溶液，封板，室溫避光孵育15min。

1.3.5 終止反應(yīng)

每孔加50μL 終止液，于450nm 波長處測定各孔吸光值。

1.3.6 判定方法

標準樣品判定：陽性對照樣品抑制率（PI）=（1-陽性對照孔吸光值/酶標對照孔吸光值）×100%＞60%；陰性對照樣品抑制率（PI）=（1-陰性對照孔吸光值/酶標對照孔吸光值）×100%＜40%；結(jié)果判定：樣品抑制率（PI）=（1-待檢樣品吸光值/酶標對照孔吸光值）×100%，PI ＞50%為陽性，PI ≤50%為陰性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010 版軟件中數(shù)據(jù)分析功能對試驗羊的血清樣品抗體水平進行數(shù)據(jù)分析，試驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示。

2 結(jié)果

2.1 有效性判定

由表1 可得，陽性對照組抑制率（PI）為90.76%＞60%，陰性對照組抑制率（PI）為5.55%＜40%。根據(jù)檢測試劑盒標準樣品判定可得，本次試驗的陽性對照組和陰性對照成立，進一步表明可根據(jù)試劑盒內(nèi)結(jié)果判定標準對檢測血清樣品進行判定。

表1 陽性對照組和陰性對照組檢測結(jié)果

2.2 抗體檢測結(jié)果

由表2 可得，20 份免疫羊血清均為小反芻獸疫抗體陽性，其中平均吸光值在0.10～0.19，平均阻斷率維持在80%～90%。第一次檢測與第二次檢測的阻斷率差異性較小，進一步表明阻斷ELISA 檢測方法較穩(wěn)定。

3 討論

小反芻獸疫是一種急性、烈性、接觸性傳染病，2007 年由西藏阿里地區(qū)傳入我國，并證實為境外輸入疫病[5-6]，我國已將此類病列入一類動物疫病。為保護易感動物，切斷傳播鏈，免疫小反芻獸疫疫苗為主要防控措施。評價免疫效果的主要方法是抗體監(jiān)測。故抗體監(jiān)測對小反芻獸疫防控措施尤為重要。本試驗選用阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒對免疫羊血清進行抗體監(jiān)測，結(jié)果顯示陽性對照組抑制率（PI）為90.76%，陰性對照組抑制率（PI）為5.55%，根據(jù)檢測試劑盒標準樣品判定可得，本次試驗的陽性對照組和陰性對照成立；20 份免疫羊血清檢測均為小反芻獸疫抗體陽性，其中平均吸光值在0.10～0.19，平均阻斷率維持在80%～90%。第一次檢測與第二次檢測的阻斷率差異性較小，進一步表明阻斷ELISA 檢測方法較穩(wěn)定。