國產化時間分辨免疫熒光法游離雌三醇檢測試劑盒性能驗證

宋勝楠，王玨

江蘇省人民醫(yī)院產科，江蘇南京 210003

對于出生缺陷疾病，目前尚無有效的治療手段，通過產前篩查和產前診斷技術在宮內及時發(fā)現(xiàn)胎兒染色體數(shù)目或結構異常，進行二級預防及干預是出生缺陷防治的重要技術手段。中孕期母血清產前篩查是在孕15～20+6周期間抽取孕婦的肘靜脈血（空腹），通過定量測定血清中甲胎蛋白（alphafetoprotain，AFP）、人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，HCG）、游離雌三醇（unconjugated estriol，UE3）濃度值，結合孕婦年齡、孕周、體重、既往妊娠史、有無糖尿病、吸煙等因素，通過風險計算軟件評估胎兒罹患唐氏綜合征（21三體）、愛德華綜合征（18三體）及開放性神經管缺陷（open neural tube defect，ONTD）的風險，根據(jù)風險高低決定是否進行下一步產前診斷。根據(jù)文獻報道胎兒患有21三體時，孕婦血清中游離雌三醇含量平均減少約1/4，胎兒患有18三體時UE3平均水平也會降低[1-2]。本研究按照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準WS/T420-2013《臨床實驗室對商品定量試劑盒分析性能的驗證》要求進行[3]，從精密度、正確度、線性范圍3個方面，對一款國產化UE3時間分辨免疫熒光定量檢測試劑盒進行評估，判斷該試劑盒是否能達到實驗要求并滿足臨床需求，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

①精密度驗證樣本采用市售中孕期血清學篩查測定室內質控品（批號：20170401）。正確度驗證樣本采用國家衛(wèi)健委臨檢中心2019年中孕期母血清產前篩查測定室間質量評價凍干品（批號：201911、201921、201931、201941、201951）。以上樣本均按照說明書要求復溶后分裝保存。線性范圍樣本來源于2018年10月—2019年4月在江蘇省婦幼保健院采集的孕中期血清學篩查臨床送檢血樣，孕周為15～20+6周，血樣均在采集后24 h內離心分裝血清，并在采樣后5個工作日內完成定量檢測。檢測完成后血清樣本置于-70℃醫(yī)用冰箱保存。在本實驗中所有血清樣本均提前24 h取出復溫至室溫并混合均勻[4]。

待性能驗證的國產游離雌三醇檢測試劑盒（時間分辨免疫熒光法）（批號：8600106450）；室內質控品（批號：20170401）。所有試劑均在有效期內使用。

②儀器為AutoDELFIA1235全自動時間分辨儀。

1.2 方法

1.2.1 UE3精密度驗證采用本實驗室在用的中孕期血清學篩查室內質控品（低、中、高3個濃度）作為精密度測試樣本，共行5批實驗檢測，每批實驗對3個濃度樣本重復測量3次，每個濃度可獲得15個測量值，計算變異系數(shù)（coefficient variations，CV），包括批內變異系數(shù)（CV批內）、批間變異系數(shù)（CV批間）和總變異系數(shù)（CV總），與試劑盒廠家聲稱的CV值進行比較，驗證其精密度是否可靠。

1.2.2 UE3正確度驗證采用國家衛(wèi)健委臨檢中心2019年第一次中孕期母血清學篩查測定室間質量評價凍干品作為正確度測試樣本，5個濃度均在醫(yī)學決定水平范圍內。共進行5批實驗檢測，每批實驗對5個濃度樣本重復測量3次，每個濃度獲得15個測量值。統(tǒng)計分析測量偏移值和參考標準不確定度，按照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準WS/T420-2013[3]的要求判斷試劑盒的正確度是否可靠。

1.2.3 UE3線性范圍驗證在驗證范圍內，取妊娠36周的孕婦血清作為線性范圍驗證中的高濃度樣本[5]，取本實驗室臨床檢測中的極低濃度樣本作為低濃度樣本。按照表1的比例混合制備不同濃度的6個血清樣本。每個樣本測量3次，在一批測量中完成。考察測量均值與理論值的線性關系[6]。

表1 UE3線性范圍實驗樣本制備方法（混合比例）

1.3 觀察指標

1.3.1 UE3精密度低、中、高3個濃度樣本的CV批內、CV批間、CV總與試劑盒廠家聲稱的CV值進行比較。

1.3.2 UE3正確度按照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準WS/T420-2013[3]的結果判讀規(guī)則：當實驗室參考物質測量偏移值＞參考物質賦值的不確定度，則應將此偏移值的驗證區(qū)間與參考物質賦值進行比較，如在驗證區(qū)間內說明差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），應認可本試劑盒正確度驗證可靠[7]。

本次驗證采用國家衛(wèi)健委臨檢中心2019年中孕期母血清學篩查測定室間質量評價凍干品（批號201911、201912、201913、201914、201915），作為參考物質[8]。按照行業(yè)標準提供的計算公式，根據(jù)國家衛(wèi)健委臨檢中心公布的室間質量評價結果，參考物質賦值分別為2.60、4.50、1.80、6.00、6.90，并計算出本參考物質賦值的不確定度。

1.3.3 UE3線性范圍 按照比例配置6個理想線性濃度樣本后，對其進行檢測，以測量均值為橫坐標，理論值為縱坐標，擬合曲線方程，得出相關系數(shù)，按WS/T2013判讀規(guī)則，r2＞0.995v0即可判斷廠家聲稱的線性范圍符合要求[3]。

2 結果

2.1 精密度結果

3個濃度的批內變異系數(shù)均小于廠家聲稱的10.00%；批間變異系數(shù)也均0小于廠家聲稱的15.00%；總變異系數(shù)分別為低濃度5.00%、中濃度3.00%、高濃度3.90%，小于廠家聲稱的總變異系數(shù)不超過5.00%。見表2。

表2 UE3精密度驗證批內及批間變異系數(shù)結果（%）

2.2 正確度結果

比較后發(fā)現(xiàn)，5個參考物質的測量偏移值均大于參考物質賦值的不確定度。因此，繼續(xù)計算各個測量偏移值的驗證區(qū)間，結果提示5個參考物質賦值均在測量偏移值的驗證區(qū)間內。見表3。

表3 正確度驗證測量數(shù)據(jù)(nmol/L)

2.3 UE3線性范圍

測量均值和理論值,得出相關系數(shù)r2=0.995 4＞0.995v0，表明廠家聲稱的線性范圍符合要求。見表4、圖1。

表4 UE3線性范圍驗證血清測量濃度結果

圖1 UE3線性范圍驗證測量值和理論值擬合曲線

3 討論

本實驗室之前一直使用芬蘭全進口時間分辨免疫熒光定量UE3檢測試劑盒，但由于原材料缺乏，進口試劑停止生產并且完成了國內轉產，本院在使用國產化試劑盒之前要按照要求完成國產化試劑盒的性能驗證以確保能適用于臨床[9-10]。

為對一款國產時間分辨免疫熒光定量UE3檢測試劑盒進行性能驗證，本實驗室從精密度、正確度、線性范圍進行評價，了解該試劑盒的分析性能能否達到中孕期母血清產前篩查UE3檢測的臨床檢驗要求[11]。采用AutoDELFIA1235全自動時間分辨儀進行檢測，驗證方法按照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準WS/T420-2013《臨床實驗室對商品定量試劑盒分析性能的驗證》要求進行[13]。游離雌三醇檢測試劑盒用于中孕期唐氏綜合征篩查，再結合其他指標綜合判斷胎兒罹患21-三體，18-三體，開放性神經缺陷的風險。臨床醫(yī)生根據(jù)不同的的唐篩結果對后續(xù)的產前診斷做出不同的判斷[12]。

在精密度驗證實驗中，本實驗室選擇穩(wěn)定性良好的市售室內質控品作為測試樣本，分別計算低、中、高3個濃度樣本的批內變異系數(shù)、批間變異系數(shù)、總變異系數(shù)[12-13]。3個濃度的批內變異系數(shù)分別為低濃度4.72%、中濃度2.22%、高濃度2.25%均遠遠小于說明書聲稱的10.00%；批間變異系數(shù)分別為低濃度2.76%、中濃度2.26%、高濃度3.33%，均小于說明書聲稱的15.00%；總變異系數(shù)分別為低濃度4.00%、中濃度3.00%、高濃度3.90%，小于說明書聲稱的總變異系數(shù)不超過5.00%。按照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準WS/T420-2013判讀標準，對比實驗室得出的數(shù)值和說明書聲稱的數(shù)值得出，驗證結果本試劑盒精密度符合要求并能滿足實驗室臨床檢驗要求。

在正確度驗證的實驗過程中，關于參考物質的選擇，根據(jù)WS/T2013建議可首選新鮮冷凍人血清或其他未經加工的人類物質，包括檢驗醫(yī)學溯源聯(lián)合委員會公布的二級參考物質，但是此類參考物質不易獲得。故本實驗室按照WS/T2013建議，選擇大型能力比對或室間質評的樣本，即國家衛(wèi)健委臨檢中心室間質評樣本作為參考物質。參考物質的賦值及不確定度，來源于這次室間質評國家衛(wèi)健委臨檢中心公布的數(shù)據(jù)[14]。

按照行業(yè)標準的結果判讀規(guī)則：當實驗室參考物質測量偏移值＞參考物質賦值的不確定度，則應將此偏移值的驗證區(qū)間與參考物質賦值進行比較，根據(jù)本次檢測結果及統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，5個參考物質的賦值均在測量偏移值的驗證區(qū)間之內，說明差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），本試劑盒正確度驗證可靠，同時能夠滿足臨床檢驗需求[15]。

在線性范圍驗證時，要求所配置的理想線性濃度樣本，盡量和臨床樣本性狀一致，因此孕婦樣本是線性范圍驗證的理想樣本來源。本院孕婦血清學篩查樣本庫的采樣時間為孕15～20+6周，樣本游離雌三醇濃度大多＜20 nmol/L，達不到線性范圍的高值。故本次性能驗證中，選擇了妊娠36周的孕婦血樣作為接近F點的高濃度樣本，在樣本庫中選擇極低濃度的孕婦血樣作為低濃度樣本，按照比例配置6個理想線性濃度樣本，使其均勻分布于試劑盒的標準曲線檢測區(qū)間。結果顯示，本次測量均值與理想值的擬合曲線方程的相關系數(shù)符合要求，廠家聲稱的線性范圍符合臨床檢驗要求。

綜上所述，本國產游離雌三醇時間分辨免疫熒光定量檢測試劑盒，從精密度、正確度和線性范圍驗證結果顯示，其分析性能符合醫(yī)學實驗室臨床檢驗需求。