貴陽地區1 163例脊髓性肌萎縮癥篩查現狀及基因診斷策略分析

李媛媛，馬星衛，韓媛媛，黃盛文

1.貴州省人民醫院檢驗科，貴州貴陽 550002；2.貴州省人民醫院產前診斷中心，貴州貴陽 550002；3.貴州大學醫學院，貴州貴陽 550025

脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy,SMA）是一種神經肌肉疾病，屬于常染色體隱性單基因遺傳病[1]。2018年5月，脊髓性肌萎縮癥被列入國家衛生健康委員會等部門聯合制定的《第一批罕見病目錄》[2]。嬰幼兒期起病的患兒，很大概率無法活到2歲。因此，SMA也被稱為2歲以下嬰幼兒的頭號致死性遺傳病。據統計，SMA在活產嬰兒的發病率為1/10 000～1/6 000[3]，SMA缺陷基因的人群攜帶率為1/40～1/50[4]。雖然SMA可防可治，但鑒于SMA患者病情嚴重、人群攜帶率高、危害性大以及昂貴的治療費用，現階段攜帶者篩查、產前診斷仍然是主要的預防手段，攜帶相同致病基因的父母通過產前診斷或第三代試管嬰兒的方法就可以阻斷患兒的出生。因此，美國醫學遺傳學會（ACMG）、美國婦產科學會（ACOG）在先后發布了多個攜帶者篩查的指南，強烈建議每一位計劃懷孕或已懷孕女性篩查SMA[5-8]。本研究于2018年1月—2019年12月對貴陽地區貴州省人民醫院1 163例孕婦人群進行了首次大樣本量SMA攜帶者篩查。其篩查流程和經驗或將有助于SMA遺傳咨詢和產前基因診斷在貴陽地區的推廣，對于優生優育、有效預防SMA胎兒的出生具有重要的臨床意義。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

對常規產檢的13 478例孕婦進行SMA攜帶者篩查宣教，其中1 163例表型正常的孕婦自愿接受篩查，接受率約為8.62%。回顧性分析孕婦臨床資料，年齡17～44歲，平均（29.74±2.1）歲；孕周10～24周，平均（17.8±2.3）周。

1.2 納入與排除標準

納入標準：表型正常、無SMA家族史、自愿接受篩查的孕期女性。排除標準：使用肝素抗凝的全血樣本。

1.3 方法

①樣本釆集受檢者外周靜脈血2 mL，枸櫞酸鈉或EDTA抗凝，置于2～8℃冷藏條件下保存，并在1周內完成檢測。

②DNA提取采用核酸提取試劑提取外周血基因組DNA，NanoDrop Lite分光光度計測定DNA濃度，要求純度（A260/A280）為1.7～2.0，濃度為2.0～180 ng/μl。-20℃保存，避免反復凍融。

③基因檢測運用多重熒光定量PCR技術（自建方法），對運動神經元存活基因（survival motor neuron 1,SMN1）拷貝數進行檢測。PCR擴增條件為：UNG酶50℃反應1 min；95℃預變性5 min，95℃變性15 sec，60℃延伸35 sec，共40個循環；報告基團VIC、CY5。

④結果判斷根據比較Ct法進行SMN1基因拷貝數的定量分析，純合缺失型、雜合缺失型和正常型對應的SMN1基因拷貝數分別為：0、1和2。計算公式如下：待測樣本（或對照樣本）目的基因△Ct=Ct_目的基因-Ct_參比基因；待測樣本目的基因△△Ct=△Ct_待測樣本-△Ct_對照樣本；待測樣本目的基因RQ值（Expression值）=2-△△Ct。

⑤產前診斷若孕婦檢測為SMA攜帶者，則對其配偶進行攜帶者篩查；若夫婦雙方均為SMA攜帶者，經知情同意后于孕16～22周，在B超引導下經腹壁行羊膜腔穿刺術，用一次性無菌注射器緩慢抽取羊水10 mL，按上述方法和DNA測序法同時對胎兒的SMN1基因進行檢測。分娩后提取胎兒組織基因組DNA，檢測SMN1基因以進一步證實產前診斷的結果。

⑥隨機抽取經自建方法檢測為純合缺失型、雜合缺失型和正常型的樣本各5例，送第三方實驗室進行多重連接探針擴增技術（multiplex ligationdependent probe amplification,MLPA）檢測，比較兩種方法結果的一致性。

1.4 觀察指標

試驗數據采用四格表進行處理，計算陽性符合率、陰性符合率、總符合率。陽性符合率=100%[a/(a+c)]，陰性符合率=100%[d/(b+d)]，總符合率：是評估檢測結果和明確診斷結果總一致程度的指標，它是所有檢測結果中真正的陽性結果和真正的陰性結果所占的百分比。總符合率=100%[(a+d)/n]。見表1。

表1 比較兩種方法結果的一致性

1.5 統計方法

采用Excel 16.64分析數據。配對卡方（χ2）檢驗：說明的是檢出率或陽性率的高低是否相同。Kappa檢驗：說明的是被考核試劑與對比試劑/對比方法檢測結果的一致性程度。

2 結果

2.1 樣本SMN1基因檢測結果

所有樣本均檢測成功，通過對SMN1基因外顯子7的定量檢測，可檢出SMN1基因純合缺失型、雜合缺失型和正常型，對應的SMN1基因拷貝數分別為0、1和2。見圖1。

圖1 SMN1基因PCR檢測結果

續圖1

2.2 1 163例產檢孕婦SMA攜帶 率

對13 478例孕婦進行SMA攜帶者篩查宣教，僅有1 163例孕婦自愿接受篩查，接受率為8.62%。在接受篩查的1 163例產檢孕婦中，檢出26例為SMA攜帶者，攜帶率為1/45(檢出率2.24%)。經遺傳咨詢，12例攜帶者的配偶自愿接受SMA篩查，接受率為46.15%。最終檢測出同為SMA攜帶者的夫婦2對。

2.3 SMA產前診斷

對2例高風險胎兒進行產前基因診斷，孕18周時行羊水穿刺，胎兒SMN1基因產前診斷結果：其中1例為純合缺失，基因拷貝數為0，確診為SMA胎兒，根據孕婦夫婦意愿選擇終止妊娠；另外1例為雜合缺失，基因拷貝數為1，確診為攜帶者，出生后隨訪1年發育未見異常。

2.4 MLPA驗證SMN1

基因純合缺失型、雜合缺失型和正常型全部檢出，兩種方法的一致性為100%。見圖2。

圖2 SMN1基 因MLPA結果

3 討論

由于中國人口基數龐大，罕見病在我國并不“罕見”，而SMA又屬于罕見病中的常見病。中國目前已有SMA患者近3萬例，根據每年大約1 600萬的新生兒出生計算，每年新增SMA患兒1 700～2 800例。近年來，隨著更多基因治療藥物的普及，為SMA患者和家庭帶來了新的選擇，國家對SMA的關注也逐漸提高，先后出臺多個專家共識和指南對SMA的篩查、診斷及治療作出了明確指導[9-11]。

本研究對13 478例孕婦進行SMA篩查的宣教，有1 163例自愿接受篩查，接受率為8.62%。這是貴陽地區首次大樣本量的SMA攜帶者篩查，但接受率低于國內大部分地區，2021年江蘇地區的接受率為34.90%，10年前臺灣地區報道的接受率為10.60%[12-13]，究其原因可能是本地區人群對遺傳性疾病認識程度較低，缺乏疾病相關知識的科普，未能引起人們的普遍重視。在接受篩查的孕婦中檢出26例SMA攜帶者，攜帶率為1/45，與其他研究結果一致[14]。經遺傳咨詢，12例攜帶者的配偶自愿接受SMA篩查，接受率為46.15%，由此可見，加強SMA攜帶者篩查和遺傳咨詢有利于提高人群接受程度。目前，貴陽地區在SMA的研究方面僅有少數醫院為已懷孕婦女提供SMA的攜帶者篩查，較少有基因診斷方面的研究。因此，為有效控制貴陽地區SMA患兒的出生，提高人口素質，減輕家庭及社會的負擔，有必要在貴陽地區建立完善的基因診斷方法，健全產前篩查與產前診斷流程，為全面開展SMA的防控提供基礎數據和技術支持。

在中南大學的一項研究中發現，“2+0”“1+1D”和“2+1D”3種基因型攜帶者占SMA攜帶者的7.5%，另外還有1.7%的新發突變[15]。因此，進行完善的遺傳咨詢、全面的風險評估以及建立有效的基因檢測體系十分關鍵。①通過宣教使備孕或已孕女性了解SMA的臨床表現和嚴重程度，提高篩查接受度；②簽署知情同意書，告知檢測目的、方法及局限性，自愿接受篩查；③根據篩查結果，對攜帶者的配偶進行SMA篩查；④為高風險夫婦提供產前基因診斷和生育指導，并對篩查結果為陰性的受檢者進行殘余風險評估；⑤開展新生兒篩查，促進SMA的早期診斷和治療，爭取更好的臨床結局。