不同基因型水稻花藥培養效果的比較研究

趙沙沙 潘高峰 陳 波 房振兵 潘秀才 田永宏

（襄陽市農業科學院，湖北襄陽 441057）

花藥培養是一種快速獲得單倍體植株的常規技術，是產生單倍體植株和創制新的種質資源的重要途徑[1-2]。1968 年日本學者新關（Niizeki）和大野（Oono）首次利用水稻花藥培養技術獲得了單倍體植株[3]。中國于20 世紀70 年代開始水稻花藥培養研究，在水稻花藥培養技術體系的構建、新的種質資源創制、新品種培育上取得了很大的發展[4]。采用常規育種方法耗時長、效率低，而水稻花藥培養技術誘導產生的單倍體，表現出雙親性狀的各種重組類型，通過人工處理或自然加倍，在當代就可以獲得穩定的二倍體植株[5]，有效縮短育種周期，提高選擇效率，加快育種進程[6]。將花藥培養技術與常規育種技術相結合，可以快速改良水稻品質、產量、抗病性和生育期等性狀，對新品種培育和水稻生產具有重要意義。

水稻花藥培養再生體系受材料基因型、生理狀態、培養基組分以及培養條件等多個因素的影響，其中，基因型是影響水稻花藥培養效率最關鍵的因素[7]。研究表明，不同基因型水稻的花藥培養效率有明顯差異，雙親雜交F1的花培效率一般會介于雙親之間而偏向母本。如果雙親的花培效率高，則雜交F1的效率也會較高[8-9]。因此，可以通過篩選基因型，積累具有較高愈傷組織誘導率或者花培效率的水稻材料，組配優異的雜交組合來獲取較大量的再生植株群體[3]。目前，水稻花藥培養仍有一定的難度，尤其是秈稻花藥培養力過低，獲得的花培后代群體較小[10]，這與缺乏花藥培養再生能力高、綜合農藝性狀優良的水稻材料有很大關系。從大面積推廣應用的水稻品種或具有育種價值的水稻材料中篩選、評價高花藥培養力的水稻基因型作為花藥培養的材料具有現實性和必要性。

本研究選取常規秈稻、秈粳雜交稻、秈型雜交稻和粳型雜交稻4 種不同類型的水稻材料進行花藥培養，比較它們在花藥培養過程中的的愈傷組織誘導率和花藥培養效果，以期為水稻花培育種提供可以選擇的優良基因型。研究對提高水稻花藥培養效果、培育花培新品種以及加速水稻花藥培養愈傷組織在遺傳轉化中的應用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料選用的試驗材料共分為4 類：常規秈稻、秈粳雜交稻、秈型雜交稻和粳型雜交稻，如表1 所示。

表1 不同類型試驗材料

1.2 花藥培養方法

1.2.1 幼穗取材和低溫預處理試驗在襄陽市農業科學院團山基地進行。田間選擇生長健壯、無病蟲害、處于孕穗期的植株，晴天8：00-10：00 取帶有劍葉和倒二葉的幼穗。外部形態特征主要表現為：劍葉與倒二葉的葉枕距為8～13cm，苞大而不破，剝開苞葉可見幼穗的穎殼寬度已接近成熟大小，穎殼大多數呈黃綠色，花絲長度為穎殼的1/3～1/2。對田間選取的幼穗鏡檢時，大多數花粉發育處于單核靠邊期（即大孢子發育晚期），此時花藥形成愈傷組織的能力最強。將帶苞葉幼穗的葉片剪去留葉鞘，用75%的酒精擦拭消毒后用干凈的濕潤紗布包裹，裝入保鮮袋中密封貼上標簽，注明材料名稱和取樣時間等信息，在光照培養箱中8℃條件下進行7～11d的低溫預處理。

1.2.2 花藥接種用75%的酒精對預處理后的稻穗表面進行消毒，然后在超凈工作臺上剝除葉鞘，選取合適的帶枝小穗，置于50mL 離心管中，加入75%酒精浸泡1min 后倒掉，用無菌水沖洗1 次，然后加入新配制的3%次氯酸鈉溶液完全浸沒小穗，放在渦旋振蕩儀上振蕩25min，倒掉次氯酸鈉溶液用無菌水沖洗4～5 次，再用無菌濾紙吸干水分。在無菌條件下用剪穎抖藥法將花藥接種至誘導愈傷培養基上，每個組培瓶接種100～200 個花藥，在組培瓶上注明接種材料和時間，每個處理3 次重復。在26～28℃的黑暗條件下培養，接種30～60d 內統計愈傷組織誘導率。

1.2.3 愈傷組織分化及壯苗將已長出的約1.0～2.0mm、淡黃緊湊的新鮮愈傷組織轉移到分化培養基上，先暗培養3d，然后在26℃、1000～l500Lx、10～12h/d 光照條件下分化培養。在轉分化后30～40d內統計綠苗分化率和白苗分化率。

待綠苗長至高3～5cm 時，將其轉移至生根培養基中生根。培養約7d 后，小苗開始生根，20d 左右小苗根長達1.5～2.5cm，打開瓶蓋煉苗，3d 后洗干凈培養基，移栽到大田進行常規管理。

1.3 培養基誘導愈傷培養基、分化培養基和生根培養基分別按照表2 進行配制，pH 值均為5.7～5.9。

表2 所用培養基配方

1.4 數據統計與分析用Microsoft Excel 整理數據，計算愈傷誘導率、綠苗分化率、白苗分化率以及花藥培養力，以確定試驗材料花藥培養力（綠苗產率）的大小。試驗數據用SPSS23.0 統計軟件進行單因子方差分析以及相關性分析。計算公式如下。

愈傷誘導率（%）=誘導出的愈傷組織塊數/接種總花藥數×100

綠苗分化率（%）=分化出綠苗的愈傷組織塊數/接種愈傷組織總塊數×100

白苗分化率（%）=分化出白苗的愈傷組織塊數/接種愈傷組織總塊數×100

花藥培養力（%）=愈傷誘導率×綠苗分化率×100

2 結果與分析

2.1 常規秈稻花藥培養效果常規秈稻的花藥培養效果如表3 所示，其愈傷組織誘導率為0.18%～3.01%，禾香1 號的愈傷組織誘導率最高，福稻88的愈傷組織誘導率最低，不同材料之間的愈傷組織誘導率存在差異，有些材料間差異達顯著水平。根據愈傷組織誘導率將不同材料分為容易誘導類、較易誘導類和較難誘導類，禾香1 號和福稻99 的愈傷組織誘導率超過1%，顯著高于其他材料，為容易誘導類；粵禾絲苗和農香24 的愈傷組織誘導率超過0.5%，為較易誘導類；黃華占、華占和福稻88 的愈傷組織誘導率低于0.5%，屬于較難誘導類。所有材料誘導出的愈傷組織均未分化出綠苗。

表3 不同秈稻材料花藥培養的愈傷組織誘導率比較

禾香1 號是地方常規秈型高檔優質稻品系，米質優；福稻99 是湖北省近幾年自主選育并通過審定的秈型常規水稻品種，綜合性狀好，花藥培養又相對容易，是進行水稻花培育種的優良親本，可以選擇優缺點互補、綜合性狀好的親本與它們配制優異的雜交組合進行花藥培養以創建DH（Doubled haploid，即雙單倍體）群體。

2.2 秈型雜交稻花藥培養效果玉晶91 作為親本組配的F1雜交組合的花藥培養愈傷組織誘導率為0.19%～1.79%，玉晶91/農香24 最高，玉晶91/玉針香最低，組合間差異顯著（表4）。組合玉晶91/農香24 和玉晶91/鄂中5 號的愈傷組織誘導率均超過1%，顯著高于玉晶91/玉針香，容易誘導出愈傷組織。鄂中5 號/禾香1 號的愈傷組織誘導率為1.38%，也容易誘導出愈傷組織。所有材料誘導出的愈傷組織均未分化出綠苗。

表4 不同秈型雜交稻花藥培養的愈傷組織誘導率比較

以玉晶91 組配的F1雜交組合的愈傷組織誘導率除了玉晶91/玉針香外均較高，表明玉晶91 與某些親本間具有較好的雜種優勢和花藥培養配合力，而玉針香的愈傷組織誘導率可能較低，所以配制的F1雜交組合誘導率也較低。以愈傷組織誘導率高的禾香1 號為父本，組合鄂中5 號/禾香1 號誘導率也比較高，表明作為親本之一的愈傷組織誘導率高，F1雜交組合愈傷組織誘導率可能也比較高。

2.3 秈粳雜交稻和粳型雜交稻花藥培養效果水稻含粳稻基因的雜交稻愈傷組織誘導率、綠苗分化率、白苗分化率、花藥培養力如表5 所示。不同基因型愈傷組織誘導率存在差異，香1 號/17J42 的愈傷組織誘導率最高，可以達到79.59%（圖1-A），組合圣稻18-15//春江041/武運粳24 的愈傷組織誘導率最低，為7.68%。供試材料的綠苗分化率為2.05%～27.03%，組合圣稻18-15//春江041/武運粳24 綠苗分化率最高，為27.03%，其次為甬優1526和甬優2640，均超過10%。供試材料花藥培養白化現象嚴重，除了組合圣稻18-15//春江041/武運粳24 外，甬優2640、甬優1526、香1 號/17J42 和中浙粳18/鄂香2 號4 個材料的白苗分化率均高于綠苗分化率。供試材料的花藥培養力為1.40%～3.60%，甬優2640 的花藥培養力顯著高于其他材料，中浙粳18/鄂香2 號最低。

表5 水稻粳型材料花藥培養效果比較

總的來看，甬優1526 形成的白苗分化率較高，組合圣稻18-15//春江041/武運粳24 的愈傷組織誘導率較低，中浙粳18/鄂香2 號和香1 號/17J42雖然容易誘導愈傷組織，但形成的愈傷組織質量很差，綠苗分化率較低，以上均不適合作為水稻花藥培養育種的材料。甬優2640 的愈傷組織誘導率和綠苗分化率均較高，可以作為水稻花藥培養育種的材料（圖1-B，C，D）。

圖1 部分水稻粳型材料花藥培養愈傷組織誘導和分化情況

相關分析表明，供試材料的愈傷組織誘導率、綠苗分化率、白苗分化率和花藥培養力兩兩之間相關不顯著。

3 結論與討論

本研究對4 種不同類型的水稻進行花藥培養，結果表明花藥培養效果在基因型間有顯著差異，與前人研究結果大致相同。常規秈稻禾香1 號和福稻99 愈傷組織誘導率高，可作為水稻花培育種的優良親本。以玉晶91 為親本配制雜交組合并進行花藥培養，結果表明玉晶91 與某些親本間具有較好的雜種優勢和花藥培養配合力，在水稻花培育種中具有一定的潛在利用價值。禾香1 號愈傷組織誘導率高，組合鄂中5 號/禾香1 號也較高，表明作為親本之一的愈傷組織誘導率高，F1雜交組合愈傷組織誘導率可能也比較高。含粳稻血緣的雜交稻中，甬優1526、圣稻18-15//春江041/武運粳24、中浙粳18/鄂香2 號和香1 號/17J42 均不適合作為水稻花藥培養育種的材料。甬優2640 的花藥培養愈傷組織誘導率和綠苗分化率均較高，可以在水稻花培育種和DH 群體創建中加以利用。相關性分析表明，供試材料的愈傷組織誘導率、綠苗分化率、白苗分化率和花藥培養力兩兩之間相關不顯著。

水稻材料（即基因型）對水稻花藥培養效果的影響最重要。一般認為，花藥培養力的大小為糯稻>粳稻>秈粳雜交稻>秈型雜交稻>秈稻，同一類型的不同品種之間差異也較大[11]。目前花培育種常用的方法是在綜合農藝性狀優良的水稻品種（系）中，篩選出較高培養力的水稻材料配制優異的雜交組合來進行花藥培養。

供試水稻材料在花藥培養過程中白化現象嚴重，大部分材料的再生白苗均比再生綠苗要多。可能受到取材時期、培養基成分和培養條件等因素的影響，在愈傷組織分化階段通常會產生大量的白化苗。已有不少報道表明，花藥的生長狀態和培養條件均可以影響白化苗的產生。在誘導培養基中，適當降低錳的含量和無機鹽濃度，2，4-D、KT 或者NAA 的激素配比要適量[12]，既能提高愈傷組織誘導率，同時又能降低白苗分化率。在愈傷組織誘導和分化階段，在不影響正常生長的前提下降低溫度，減少光照也可以降低白苗分化率[12]。

開展水稻花藥培養育種工作對親本選配具有很高要求，不僅要求雙親品質優良、產量高、抗病性強、優缺點互補，而且雙親之一要具有較高的愈傷組織誘導率或者花藥培養配合力，這是提高水稻花培育種效率的關鍵。影響水稻花藥培養效率最重要的因素是基因型。秈稻花藥培養力一般偏低，愈傷組織誘導率只有0.5%，一般不超過5%，有些材料甚至不能誘導出愈傷組織[13]。為了提高秈稻花藥培養效率，可以通過篩選基因型，積累花藥培養力高的水稻材料，然后與另一個綜合性狀優良的親本配制雜交組合進行花藥培養來獲取較大量的花培后代群體。還可以把花藥培養力高的基因通過雜交、回交等手段導入到優良親本或者雜交材料中，改善花藥培養的遺傳背景來獲取較大量的單倍體植株[11]。因此，從大面積推廣應用的水稻品種或具有育種價值的水稻材料中篩選、評價高花藥培養力的水稻基因型作為花藥培養育種的材料，對新的種質資源創制、DH 群體構建和進行花培育種具有十分重要的意義。