液質聯用法測定香腸中氯霉素的不確定度評定

劉 葉，孫愛玲

（壹諾（天津）檢測服務有限公司，天津 300383）

氯霉素[1-2]作為一種典型的抗生素，在畜牧業、水產養殖、家禽飼養等行業得到了廣泛應用。但氯霉素具有一定的毒性，會對人們的血液系統造成損害，甚至有可能引起再生障礙性貧血，且該癥狀是不可逆的。因此，氯霉素的毒副作用引起了人們的重視，如何減少氯霉素的使用頻率也成為了熱點話題。為了減少該藥品的濫用對于人們造成的傷害，國家相關部門于2002年發布農業部公告第235號《動物性食品中獸藥最高殘留限量》，對該藥品的使用進行了嚴格的規定，氯霉素及其相關化學品被禁止在食用動物上使用。隨后，發布的《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單（第五批）》（整頓辦函〔2011〕1號）明確規定肉制品中不得檢出氯霉素。

測量不確定度是一個非負參數[3-10]，用來表明實驗中測量的結果之間所存在的分散性。此外，由于檢測實驗中會出現一定的測量誤差，不確定度的測定有助于提高檢測結果的準確性和可信度。本文結合相關資料[11-15]，依據《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）、《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）、《化學分析中不確定度的評定指南》（CNAS—GL006：2019）等相關文件對液質聯用法測定香腸中氯霉素的不確定度進行了評定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Thermo Fisher TSQ Quantis 液相色譜-質譜儀：配電噴霧離子源；ME 204分析天平；JW-2022HR冷凍離心機；XW-80A混合儀、HSC 24 B氮吹儀。

氯霉素標準品，純度≥99.24%；氘代氯霉素內標；乙腈，HPLC級；無水硫酸鈉、無水氯化鈉，分析純；HyperSep Retain-PEP SPE 柱；0.45 μm有機相濾膜；實驗室一級水。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

稱取50 mg氯霉素于100 mL容量瓶中，緩慢加入乙腈溶液并定容，得到氯霉素標準儲備液（500 μg·mL-1）。然后于 10 mL 容量瓶中加入 20 μL標準儲備液并使用乙腈定容，得到標準中間液（1 μg·mL-1）。使用移液槍抽取 5 μL、10 μL、50 μL、100 μL和500 μL標準工作液于提前準備好的5支不同容量瓶（10 mL）中，并在其中均加入1 mL氘代氯霉素作為內標工作液，定容，得到一系列氯霉素濃度為 0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的標準溶液，其中氘代氯霉素的濃度為 10 ng·mL-1。

1.2.2 測定方法

稱5 g絞碎均質的香腸樣品于50 mL離心管中，加內標液100 μL，加入3 mL水和一粒陶瓷均質子，混勻，加入乙腈 5 mL，渦旋并置于冷凍離心機中10 000 r·min-1離心5 min，將上清液倒入另一50 mL離心管，在殘渣中再加入ACN 5 mL，重復提取一次，兩次上清液倒入同一離心管，隨后加入4 g Na2SO4和 1 g NaCl，渦旋，8 000 r·min-1離心 5 min。活化萃取柱，將離心后的溶液轉移至固相萃取柱，收集流出液。40 ℃的條件下，氮氣吹干，1 mL水定容，過0.45 μm膜測定。

1.3 不確定度模型

不確定度數學模型為

式中：X為試樣中待測組分殘留量，μg·kg-1；C為樣液中待測物的濃度，ng·mL-1；V為試樣定容體積，mL；m為樣品稱樣量，g。

2 結果與分析

2.1 不確定度來源分析

從測定過程和確定的數學模型進行分析，氯霉素測定不確定度的來源有以下8方面：①氯霉素標準儲備液和中間液配制產生的不確定度；②容量瓶引入的不確定度；③移液槍引入的不確定度；④標準工作曲線擬合產生的不確定度；⑤樣品稱量產生的不確定度；⑥樣品定容體積產生的不確定度；⑦樣品重復測定引起的不確定度；⑧液質聯用儀引起的不確定度。

2.2 濃度C引入的不確定度urel(C)

2.2.1 重復性引起的不確定度urel(C1)

對樣品中的氯霉素含量進行重復測定，測定結果見表1。其標準偏差為S=重 復 測定產生的標準不確定度為u(C1)=0.026 4 ng·mL-1，相對標準不確定度為：

表1 重復測量濃度C的數據結果表

2.2.2 標準物質引入的不確定度urel(C2)（1）氯霉素標準儲備液和中間液配制產生的不確定度urel(C2標)。將50 mg標準品用色譜純乙腈溶于100 mL容量瓶中，隨后定容。氯霉 素 的 純 度 為（99.23±0.77）%， 其 中k=2。 因此，由純度的微小變化所引入的相對不確定度為

根據檢定證書的內容可知，實驗所用型號的天平允許誤差通常是±0.5 mg，按均勻分布，則由稱量準確度引入的標準不確定度和相對不確定度分別為

100 mL容量瓶定容引入的不確定度：100 mL容量瓶的誤差范圍是0.1 mL，按矩形分布，其標準不確定度為u(V100)=0.057 7 mL。室內溫度為（20±5）℃，而由溫度波動引起的體積變化通常是呈均勻分布的，k=乙腈的體積膨脹系數為1.37×10-3，由此可得到溫度波動引入的標準不確定度為u(V100t)=0.395 mL。則100 mL容量瓶定容引入的相對不確定度為

10 mL容量瓶定容體積引入的不確定度：根據計量書所提供的數據，10 mL容量瓶體積變化的允許誤差為±0.020 mL。按照矩形分布來計算相對不確定度，則為urel(V10)=0.001 2。由實驗室內溫度變化所導致容量瓶體積變化如上文所述，同理可得出溫度引起的相對不確定度為urel(V10t)=0.003 95。則10 mL容量瓶定容體積引入的相對不確定度為

1 000 μL 移 液 槍 移 取 1 000 μL 溶 液 時 產 生的容量允許誤差為±1%，按矩形分布，則移液槍移取體積所引入的相對不確定度為

因此，合成氯霉素標準儲備液和中間液配制產生的相對不確定度為

（2）標準曲線配制過程產生的不確定度。①容量瓶引入的不確定度urel(V容)：容量瓶允許誤差是±0.020 mL，按矩形分布，相對不確定度為

溫度波動通常也會導致物體的體積產生一些細微的變化，進而影響測試的最終結果。本實驗室內溫度是（20±5）℃，體積膨脹系數為2.1×10-4℃-1，因此溫度波動引入的相對不確定度為

②移液槍引入的不確定度urel(V器)：不同移液槍的不同量程，其允許的最大誤差不同。即便是同樣容量的移液槍，在量取不同體積溶液時也往往會出現不同的允許誤差。例如，10 μL移液槍的允許誤差為±8%；50 μL移液槍移取5 μL溶液時產生的誤差為 ±8%、取50 μL 時為±3%；1 000 μL移液槍取100 μL溶液時產生的誤差為±2%、取500 μL時為±l%。按矩形分布，可得到不同移液槍引入的相對不確定度為

式中：Vi為不同移液體積，μL；ti為容量允差誤差；V器為移液槍規格，μL。

各相應移液體積的容量允許誤差及相對不確定度見表2。

表2 移液槍移取不同體積溶液的相對不確定度表

2.2.3 標準工作曲線擬合產生的不確定度urel(CX)

氯霉素標準溶液的測定結果如表3所示，擬合可得Y=0.103 4X-0.008 157。

表3 氯霉素標準溶液的測定結果

則移液槍引入的相對不確定度為

故合成標準物質配制產生的相對不確定度為

式中：S(Y)為標準曲線的標準差；P為樣品溶液的測定次數，P=10；N為標準溶液的測定次數，N=5；a為標準曲線的截距；b為標準曲線的斜率；Cx為樣品溶液中待測物的濃度，ng·mL-1；c為標準溶液濃度的平均值，ng·mL-1；ci為校準標準溶液的濃度；Yi為單次標準溶液的響應值。

合成校準過程中產生的相對不確定度為

2.3 樣品稱量產生的不確定度urel(m)

對于5 g樣品來說，天平稱量時的最大誤差范圍是±0.000 5 g，按矩形分布，則樣品稱量產生的相對不確定度為urel(m)=0.000 058。

2.4 樣品定容體積產生的不確定度urel(V樣)

移 液 槍 導 致 的 不 確 定 度：1 000 μL移液槍容量允差是±1.0%，按矩形分布，則

溫度波動引起的體積不確定度：溫度波動（20±5）℃，所引起的體積變化呈均勻分布，溶 液 體 積 膨 脹 系 數 為 2.1×10-4℃-1， 故溫度波動引起的體積相對不確定度為urel(V樣t)=

2.5 液質聯用儀引起的不確定度urel(Q)

根據儀器校準證書可知，u=6%，k=2，則相對標準不確定度為

2.6 標準不確定度的合成

將上述各分量合成相對標準不確定度為

經過10次重復試驗，取平均值可以得出所測試樣品中的氯霉素含量是0.98 μg·kg-1，由此可得

2.7 擴展不確定度及測定結果報告

95%置信概率下取包含因子k=2，將合成標準不確定度乘以包含因子計算得到氯霉素測量結果的擴展不確定度為

U=u(X)×k=0.085×2=0.17 μg·kg-1

因此，根據實驗結果可報告表示為（0.98±0.17）μg·kg-1，k=2。

3 結論

本文使用液相色譜-質譜法對香腸中殘留的氯霉素含量進行了檢測，建立了合適的數學模型對不確定度進行計算模擬評估。結果表明，在香腸中氯霉素含量為0.98 μg·kg-1時，擴展不確定度是0.17 μg·kg-1，k=2。進一步分析可知，檢測過程中引入不確定來源對實驗結果有一定影響，主要影響因素包括標準儲備液、中間液、標準溶液的配制過程，標準曲線擬合與儀器校準。與此相比，樣品質量的準確稱量、樣品的多次重復測試等因素對實驗結果的影響較小。因此，在實驗中要保證儀器性能穩定，按時做好儀器日常維護保養，對移液器和容量瓶進行定期計量，選擇精度高、靈敏度高的器械進行標準物質和標準曲線的配制，以期降低不確定度，提高測量結果的準確度，從而為科研和檢測提供可靠的依據。