食品微生物檢驗常用培養基儲存期的研究及探討

余佳珍，鄭小玲，王征南，李 玨

（浙江食品藥品檢驗研究院，藥品微生物檢測與預警重點實驗室，浙江杭州 310052）

培養基富含微生物生長繁殖所需的各類營養物質，是微生物試驗的基礎，不恰當的制備方法、滅菌程序、貯藏條件等都會影響培養基質量，直接影響微生物試驗結果。因此，適宜的培養基制備方法、合理的儲存條件，以及質量控制實驗是提供優質培養基的保證[1]?！秾嶒炇屹|量控制規范 食品微生物檢測》（GB/T 27405—2008）有明確規定，自配培養基應在已驗證的條件下儲存[2-3]。當前，食品微生物快速檢驗方法發展如火如荼，但利用培養基對微生物計數、增菌、分離、鑒定仍是現行法規標準規定的主流方法。

脈動真空滅菌器是一種新型的飽和蒸汽滅菌器，由滅菌室腔體、夾套、腔門及密封圈、蒸汽發生器、管路系統、電氣系統和控制系統組成。該儀器采用飽和水蒸氣作為滅菌介質，經過反復抽真空和注入蒸汽[4]，待滅菌腔體達到一定的真空度后，再導入飽和蒸汽，使蒸汽在腔體內迅速擴散，并滲透到被滅菌物品的深部，從而達到有效的滅菌效果。相比傳統的高壓飽和蒸汽滅菌器具有蒸汽穿透力強、滅菌效果可靠、滅菌時間短等優點[5]。本實驗室購買的ER-2脈動真空滅菌器具有雙扉結構，滅菌完成后，被滅菌物品能通過另一扇門無菌轉運到潔凈區域內，常被用于潔凈服、密閉容器、裝有液體培養基的密閉容器或其他液體的滅菌。

適宜的培養基制備方法、貯藏條件和質量控制試驗是提供優質培養基的保證[6]，為適應食品微生物檢驗形勢的發展，提高檢驗效率，確保檢驗質量，本研究選取7.5%氯化鈉肉湯、緩沖蛋白胨水（Buffered Peptone Water，BPW）、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（Lauryl Sulfate Tryptose Broth，LST）這3種食品微生物檢驗常用液體培養基，采用脈動真空滅菌器進行滅菌處理，在儲存期內第0 d、第7 d、第14 d、第21 d、第28 d和第35 d共6個時間點對培養基的pH值、無菌性、質控指標進行考察，規范培養基的配制、滅菌和儲存過程，確保實驗室配制的培養基可滿足食品微生物檢驗的要求，旨在為實驗室日常檢驗提供可靠有效的培養基儲存方案，助力食品微生物檢驗高質量發展。

1 材料與方法

1.1 培養基

商品化脫水合成培養基：7.5 %氯化鈉肉湯（20171020）、緩沖蛋白胨水（BPW）（20171031）、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）（20190121），均購于青島高科技工業園海博生物技術有限公司；胰酪大豆胨液體培養基（1065575），購于廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器設備

ER-2脈動真空滅菌器（瑞士Getinge）；ME2002E電子天平、S400-B酸度計（瑞士Mettler Toledo）；MLS-3780高 壓 蒸 汽 滅 菌 器（ 日 本Sanyo）；SF450滅菌箱、IF450恒溫培養箱、ICP55低溫培養箱（德國Memmert）；生物安全柜（中國力康）；HYC-1378冰箱（中國海爾）。

1.3 菌種

大腸埃希菌（ATCC 25922）、弗氏檸檬酸桿菌（ATCC 43864）、糞腸球菌（ATCC 29212）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 14208）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538），均購于美國菌種保藏中心。

1.4 試驗方法

考察指標包括pH值、無菌性檢查、質量控制等指標。

1.4.1 制備菌液

按《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 培養基和試劑的質量要求》（GB 4789.28—2013），將標準儲備菌株接種到10 mL胰酪大豆胨液體培養基中，36 ℃培養24 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液制備10倍系列稀釋的菌懸液。

1.4.2 培養基制備和滅菌

根據GB 4789系列相關現行標準要求，結合培養基使用說明進行制備，使用脈動真空滅菌器121 ℃滅菌15 min，10 mL試管裝月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯采用飽和蒸汽滅菌器121 ℃滅菌15 min。具體內容見表1。

表1 食品常用培養基制備、包裝和滅菌方案

1.4.3 儲存期驗證

將滅菌完成的培養基置于2～8 ℃冰箱避光保存，分別于儲存期的第0 d、第7 d、第14 d、第21 d、第28 d、第35 d共6個時間節點對培養基的pH值、無菌性、質控指標進行實驗驗證。

（1）pH值測定。上述各培養基隨機取不少于2份，待恢復至室溫（25 ℃）進行pH測定。同一個樣品至少進行兩次測定，兩次測定的結果之差應不超過0.1 pH單位，取兩次測定的算數平均值作為結果，pH值測定結果在培養基說明書規定范圍內為合格。7.5%氯化鈉肉湯培養基配制說明書中規定的pH范圍為7.3～7.5，緩沖蛋白胨水規定的pH范圍為7.0～7.4，月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯規定的pH范圍為6.6～7.0。

（2）無菌性檢查。上述各培養基隨機取不少于5份，置各培養基對應標準規定的溫度培養14 d，結果應為無菌生長，即濁度值應為0（不生長）。7.5%氯化鈉肉湯、緩沖蛋白胨水和月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯標準規定的培養溫度均為（36 ℃±1） ℃。

（3）培養基質控指標試驗。質控指標試驗的方法及判定依據為《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 培養基和試劑的質量要求》（GB 4789.28—2013）中附錄E《實驗室使用商品化培養基和試劑的質量控制標準》。

緩沖蛋白胨水（表E.3《非選擇性增菌培養基質量控制標準》）：取每罐裝量為225 mL的緩沖蛋白胨水2罐，接種不大于100 CFU的鼠傷寒沙門氏菌菌懸液，36 ℃培養不超過18 h，目標菌的濁度值應為2（嚴重混濁）。

7.5%氯化鈉肉湯（表E.4《選擇性增菌培養基質量控制標準》）：取每罐裝量為225 mL的7.5 %氯化鈉肉湯4罐，分別用1 μL接種環接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌工作用懸液（105～107CFU·mL-1）各兩罐，36 ℃培養不超過18 h。接入金黃色葡萄球菌的濁度值應為2，接入大腸埃希菌的濁度值應為0（不生長）。

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（表E.5《選擇性液體計數培養基質量控制標準》）：取每管裝量為10 mL的月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯6管，分別用1 μL接種環接種大腸埃希菌、弗氏檸檬酸桿菌、糞腸球菌工作用懸液（105～ 107CFU·mL-1）各 2管，36 ℃培養24 h。接入大腸埃希菌和弗氏檸檬酸桿菌的濁度值應為2，且管內有氣體，接入糞腸球菌的濁度值應為0（不生長）。

2 結果與分析

2.1 無菌性檢查試驗結果

無菌性檢查試驗表明，在35 d內6個時間點對上述培養基進行無菌性檢查試驗，培養基在對應標準規定的溫度下培養14 d，結果均為陰性（濁度值為0，不生長）。見表2。

表2 不同儲存時間點各培養基的無菌性試驗結果

2.2 pH值測定結果

pH值測定結果表明，在35 d內6個時間點對上述培養基進行pH值測定，各個培養基的測定結果均在說明書規定的pH范圍內。見表3。

表3 不同儲存時間點各培養基的pH值測定結果

2.3 培養基適質控指標試驗結果

培養基適質控指標試驗結果表明，在35 d內6個時間點對上述培養基質控指標試驗，3種培養基的質控指標試驗均符合規定。見表4。

表4 不同儲存時間點各培養基質控指標結果

3 結果與分析

3.1 商品化脫水合成培養基的質量管理

新采購的商品化脫水合成培養基應由培養基管理員或其他專業人員對其進行驗收和質量控制實驗，檢驗合格后，將培養基進行入庫管理[7]。開封后的商品化脫水合成培養基要密封保存，并記錄首次開封日期。每次使用前要對內容物進行感官檢查，若發現粉末受潮或物理性狀發生改變，則不應再使用。配制培養基時，要小心稱量，尤其是具有選擇性的培養基常含有有毒物質（如膽鹽或其他選擇劑），必要時佩戴口罩或在通風柜操作，防止吸入有害物質[3]。生產廠家不同，產品批號不同，培養基的質量也會有所不同，培養基的質量控制要做到批檢驗。

3.2 培養基的制備、滅菌和儲存

培養基制備分裝完成后，應在其包裝容器外表面標明培養基的名稱和配制日期，防止使用時混拿混放或未在儲存期限內使用。培養基滅菌后要確保密閉保存。①防止水分流失。水分流失會改變培養基中各種營養成分的比例、pH和其外觀性狀，影響培養基的使用效果。②避免空氣中微生物進入引起培養基變質。變質會很大程度改變培養基的有效成分，并破壞培養基的無菌性，變質的培養基不得使用[8]。應對儲存培養基的醫用冷藏箱進行溫濕度監控和記錄，當溫濕度超過上下限值時，能及時采取控制措施。在儲存有效期內的培養基，使用前要先將培養基取出平衡至室溫，并對其進行感官檢查，如發現培養基變渾濁或性狀發生變化，應停止使用，并按實驗室相關規程處置，不得隨意丟棄。

3.3 脈動真空滅菌器操作要點

滅菌設備及滅菌參數對培養基有較大影響，對于新安裝的脈動真空滅菌器，應對其進行安裝、運行、性能確認，并定期進行檢定及驗證。滅菌參數要嚴格按照各培養基的使用說明進行設定[7]。滅菌前，取一瓶培養基放置在滅菌腔體的“最冷點”，將負載溫度探頭放在被滅菌培養基液面的幾何中心點位置，并固定完好。溫度探頭測得的溫度值要反映被滅菌培養基最深部位的溫度，探頭測得的溫度達到設定的滅菌溫度時，開始進入滅菌階段，待滅菌液體培養基按該裝量及包裝形式的液體培養基經過驗證的裝載方式進行裝載。滅菌時，培養基的裝載量不能超過已驗證的最大裝載量，裝載過密會影響滅菌效果[9]。

3.4 小裝量液體培養基滅菌要點

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯在使用脈動真空滅菌器進行滅菌時，滅菌后培養基的顏色存在異常，進行第0 d質控指標試驗時發現，培養基的選擇性效果不明顯。經研究發現，月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯的包裝容器是玻璃試管，且裝量少只有10 mL，使得滅菌時溫度探頭難以固定放置，測量溫度不準確，導致實際的滅菌時間和設定的滅菌時間不符，造成培養基滅菌不徹底或過度滅菌，影響培養基質量，所以最終選擇傳統高壓蒸汽滅菌器進行滅菌。保證培養基中營養成分不被破壞，避免培養基中其他物質因高溫發生反應而影響其質量[10]。

綜上所述，7.5%氯化鈉肉湯、緩沖蛋白胨水（BPW）、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）這3種食品常用培養基根據其使用說明及GB 4789系列法規標準要求制備，使用脈動真空滅菌器121 ℃滅菌15 min（10 mL試管裝月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯采用飽和蒸汽滅菌器121 ℃滅菌15 min），2～8 ℃避光密閉儲存，將儲存期限限定在35 d內，培養基的pH值、無菌性及指質控指標均符合規定，可以確保培養基質量。