高效液相色譜法同時測定減肥類保健食品中6種蒽醌苷元的含量

黃 媛

（遼寧省檢驗檢測認證中心，遼寧 沈陽 110033）

蒽醌（anthraquinone，AQ），又名9,10-蒽醌，指在 C9，C10位具有羰基的蒽類化合物，屬于多環芳烴類衍生物。在自然界中，蒽醌類化合物常存在于廖科、鼠李科、茜草科、百合科等高等植物中，中藥材如大黃、蘆薈、決明子、何首烏、虎杖等中均含有蒽醌類成分。蒽醌類化合物具有泄下、抗菌、利尿、止血、促智、抗癌、明目、抗病毒、抗衰老、保肝利膽、抗紫外線、抗誘變等多種生物活性[1]。在減肥茶類保健食品中，起泄下作用的主要是蒽醌類成分。毒代動力學分析和動物試驗研究發現，蒽醌的急性毒性較低，但是慢性毒性試驗結果表明蒽醌會導致動物貧血，對動物的肝、腎、脾、膀胱等器官有一定危害作用，甚至可引起大小鼠肝臟、腎臟、膀胱等臟器癌變[2]。長期服用蒽醌類瀉藥的人群，大腸黑變病的發病率均較高[3-7]。目前，我國對于蒽醌類化合物的限量要求主要是《中國藥典》中對各類含有蒽醌類化合物的中藥材的每日服用量要求，對減肥類保健食品并沒有明確要求。因此，建立一種減肥類保健食品種總蒽醌類化合物的檢測方法，為保健食品的限量要求提供有效的數據支撐是十分必要的。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters2695高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器，美國Waters公司）；Milli-Q高純水發生器（美國Millipore公司）；CR21N高速離心機（日本HITACHI公司）；超聲波清洗器（德國BANDELIN公司）；HH-4型數顯恒溫水浴鍋（金壇華榮儀器制造有限公司）；分析天平（感量0.0001 g，德國賽多利斯）；BDS HYPERSIL C18色譜柱（Thermo Fisher Scientific，4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；有機濾膜（0.22 μm，上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.2 試藥

空白基質：柑普茶（含蒽醌類成分的保健食品多為代用茶，因此選擇茶葉基質做為空白基質）。減肥類保健食品樣本共18批，來源于藥店購買和網絡購買。

甲醇（色譜純，Fisher公司）；甲醇、二氯甲烷、磷酸、鹽酸、硫酸（分析純，國藥集團化學制劑有限公司）；試驗用水均為超純水（GB/T 6682-2008《分析實驗室用水規格和試驗方法》規定的一級水）；橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品（純度大于95 %，中國食品藥品檢定研究院）。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 標準溶液配制 分別準確稱取按其純度折算為100 %質量的對照品各10 mg，橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚用甲醇配制成質量濃度為500 μg/ml的標準儲備液，大黃素甲醚用二氯甲烷配制成質量濃度為500 μg/ml的標準儲備液，大黃酸用適量甲醇超聲1 h使溶解，用甲醇定量配制成質量濃度為100 μg/ml的標準儲備液。分別精密量取橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚標準儲備液0.02，0.1，0.2，0.4，1.0 ml，再精密量取大黃酸標準儲備液0.1，0.5，1.0，2.0，5.0 ml分別置入5個10 ml量瓶，加甲醇稀釋制度，搖勻。配制成濃度分別為1，5，10，20，50 μg/ml的標準系列工作溶液，現用現配。

2.1.2 樣品前處理 稱取樣品0.50 g，置入100 ml圓底燒瓶，加入20 ml甲醇，沸水浴回流提取1 h，放冷至室溫，以甲醇補足減失的重量。8000 r/min離心5 min，取上清10 ml，蒸干，加10 ml稀鹽酸，65 ℃超聲1 h，立即冷卻，用二氯甲烷振搖提取3次，每次10 ml，合并二氯甲烷層，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至10 ml量瓶，加甲醇至刻度，混合均勻，經0.22 μm有機系微孔濾膜過濾后供高效液相色譜儀檢測分析。

2.1.3 色譜檢測條件 色譜柱：BDS HYPERSIL C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；流動相A為0.1 %磷酸水溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫程序：0～10 min，25 % B；10～15 min，25 %～60 %B；15～20 min，60 %～95 %B；20～22 min，95 %B；22～25 min，95 %～25 %B；25～30 min，25 %B；流速1.0 ml/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μl。采集6種蒽醌苷元于200～600 nm波長范圍內的吸收光譜圖，在285 nm和430 nm下進行定量檢測。

2.2 結果與分析

2.2.1 水解用酸的選擇 蒽醌苷類的水解通常采用不同濃度的酸。本研究考查了稀鹽酸、8 %鹽酸、2.5 mol/L硫酸對6種蒽醌苷元的影響。選取添加多種含蒽醌類中藥成分的樣品，以一定比例混合均勻，研磨粉碎（以下簡稱樣品），稱取0.5 g樣品，置入100 ml圓底燒瓶，加入甲醇20 ml沸水浴回流提取1 h，放冷至室溫，以甲醇補足減失的重量。8000 r/min離心5 min，分別取上清5 ml 3份，蒸干，分別加入稀鹽酸、8 %鹽酸和2.5 mol/L硫酸各10 ml，于65 ℃超聲1 h，立即冷卻，分別用二氯甲烷振搖提取3次，每次10 ml，合并二氯甲烷層，蒸干，殘渣用甲醇5 ml溶解。結果表明，采用稀鹽酸水解6種蒽醌苷元的含量更高。

2.2.2 提取方案的設計 本研究依據《中國藥典》中各種含蒽醌中藥材及成藥的提取方法，設計減肥類保健食品中蒽醌類化合物的提取方法。

方案一：稱取樣品0.5 g，置入100 ml圓底燒瓶，加入甲醇-鹽酸（10:1）20 ml，沸水浴回流提取1 h，放冷至室溫，甲醇補足減失的重量，8000 r/min離心5 min，取上清2 ml，加入2 % 氫氧化鈉溶液2 ml，加甲醇定容至10 ml。

方案二：稱取樣品0.5 g，置入100 ml圓底燒瓶，加入甲醇20 ml，沸水浴回流提取1 h，放冷至室溫，以甲醇補足減失的重量，8000 r/min離心5 min，取上清10 ml，蒸干，加10 ml稀鹽酸超聲5 min，加入二氯甲烷10 ml沸水浴回流提取1 h，放冷至室溫，分取二氯甲烷層，水層再用二氯甲烷振搖提取2次，每次10 ml，合并二氯甲烷層，蒸干，殘渣加甲醇10 ml溶解。

方案三：稱取樣品0.5 g，置入100 ml圓底燒瓶，加入甲醇20 ml，沸水浴回流提取1 h，放冷至室溫，以甲醇補足減失的重量，8000 r/min離心5 min，取上清10 ml，蒸干，加10 ml稀鹽酸，65 ℃超聲1 h，立即冷卻，用二氯甲烷振搖提取3次，每次10 ml，合并二氯甲烷層，蒸干，殘渣加甲醇10 ml溶解。

方案四：稱取樣品0.5 g，置入100 ml三角瓶，加入甲醇20 ml，65 ℃超聲1 h，放冷至室溫，以甲醇補足減失的重量，8000 r/min離心5 min，取上清10 ml，蒸干，加10 ml稀鹽酸，65 ℃超聲1 h，立即冷卻，用二氯甲烷振搖提取3次，每次10 ml，合并二氯甲烷層，蒸干，殘渣加甲醇10 ml溶解。

方案五：稱取樣品0.5 g，置入100 ml圓底燒瓶，加入甲醇20 ml，沸水浴回流提取1 h，放冷至室溫，以甲醇補足減失的重量，8000 r/min離心5 min，取上清10 ml，加入2 ml鹽酸沸水浴回流提取1 h，冷卻至室溫，轉移至20 ml容量瓶，加入2 ml 2 %氫氧化鈉溶液2 ml，加甲醇定容至刻度。

方案六：稱取樣品0.5 g，置入100 ml圓底燒瓶，加入甲醇20 ml，沸水浴回流提取1 h，放冷至室溫，以甲醇補足減失的重量，8000 r/min離心5 min，取上清10 ml，蒸干，加10 ml稀鹽酸沸水浴回流提取1 h，立即冷卻，用二氯甲烷振搖提取3次，每次10 ml，合并二氯甲烷層，蒸干，殘渣加甲醇10 ml溶解。

采用方案一～六提取減肥類保健食品中6種蒽醌苷元含量結果見表1。

表1 采用不同方法提取6種蒽醌苷元的含量結果/10-2 mg·g-1

由表1可見，采用方案一提取蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的提取效率最高，采用方案三提取橙黃決明素、大黃酸的提取效率最高，綜合考慮6種蒽醌苷元的總量，最終本研究采用方案三做為提取方法。

2.2.3 色譜條件的選擇及優化 本研究分別考察了以甲醇-0.1 %磷酸溶液、乙腈-0.1 %磷酸溶液、乙腈-5 mmol/L磷酸二氫鉀+0.1 %磷酸溶液、甲醇-5 mmol/L磷酸二氫鉀+0.1 %磷酸溶液做為流動相系統。結果表明，以甲醇-0.1 %磷酸溶液做為流動相6種目標化合物的響應更高、分離效果更好。6種蒽醌苷元在BDS HYPERSIL C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）上的出峰順序見圖2。

2.2.4 檢測波長選擇 橙黃決明素在285 nm處有最大吸收，因此選擇285 nm做為檢測波長。其余5種蒽醌苷元在200～600 nm波長范圍內的吸收均呈現3個吸收峰，分別在約220，260～285和430 nm。由于220 nm為紫外的末端吸收，因此不采用。實際樣品測定發現285 nm附近的干擾雜質更多，因此選擇430 nm做為檢測波長。6種蒽醌苷元對照品在285 nm及430 nm的色譜峰見圖1、圖2，實際樣品在285 nm及430 nm的色譜峰見圖3、圖4。

圖1 6種蒽醌甘元混合標準溶液在285 nm的色譜圖

圖2 6種蒽醌甘元混合標準溶液在430 nm的色譜圖

圖3 樣品在285 nm的色譜圖

圖4 樣品在430 nm的色譜圖

2.2.5 方法學驗證

2.2.5.1 專屬性 本方法通過二極管陣列檢測器采集各化合物200～600 nm范圍內的吸收圖譜，采用285 nm及430 nm進行定量檢測，方法專屬性高，在空白樣品和加標回收樣品的色譜圖中未發現干擾峰，表明方法具有較好的選擇性。

2.2.5.2 線性范圍、相關系數、檢出限和定量限 用甲醇配制系列標準工作溶液，用化合物峰面積對質量濃度繪制標準曲線。6種蒽醌苷元在1～50 μg/ml質量濃度范圍內線性良好，其線性相關系數r均高于0.998。以3倍和10倍信噪比分別確定方法的檢出限和定量限，結果見表2。

表2 方法的線性、相關系數、檢出限及定量限

2.2.5.3 準確度和精密度 以茶葉為代表基質，分別在3個水平下進行加標回收試驗，考察方法的準確度（以加標樣品的回收率表示）和精密度（以RSD表示），結果見表3。

由表3可見，6種蒽醌苷元的平均回收率為85.2 %～98.1 %，精密度為0.8 %～6.2 %，表明方法的準確度較好、精密度較高。

表3 6種蒽醌苷元的空白樣品加標回收和精密度（n=6）

2.2.6 實際樣品測定 采用本研究建立的方法檢測18批次減肥類保健食品，其中代用茶樣品16批，膠囊樣品1批，壓片糖果樣品1批。樣品信息及結果見表4。

表4 減肥類保健食品中6種蒽醌苷元的含量/10-2 mg·g-1

3 討論

通過研究市售減肥類保健食品發現，該類保健食品中主要添加的中藥類成分為決明子、番瀉葉、蘆薈等，其中含有的蒽醌類成分為結合蒽醌和游離蒽醌，由于起瀉下作用的是總蒽醌類成分，除番瀉苷外結合蒽醌類成分的苷元主要為橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚等6種。

國家市場監督管理總局2020年發布的《保健食品理化及衛生指標檢驗與評價技術指導原則》（2020年版）[8]中規定了保健食品中總蒽醌的測定方法，堿液顯色后采用紫外分光光度法進行測定，但該法干擾較大，專屬性不高，不能真實反應該類化合物的含量。《中國藥典》自2005年版一部起含有蒽醌類成分的中藥材與中成藥的檢測已采用HPLC，因此本方法采用HPLC檢測，建立一種通用的檢測保健食品中蒽醌類化合物含量的方法。本研究建立的HPLC同時測定減肥類保健食品中的6種蒽醌苷元的方法，簡便快速、準確可靠、靈敏度高、抗干擾能力強，可為制定減肥類保健食品中總蒽醌的含量測定的檢測標準提供依據，并可用于大批量的減肥類保健食品中總蒽醌含量的日常監測分析。