頂空氣相色譜法同時測定索拉非尼中8種殘留溶劑的含量

趙國敏，劉彩霞，盧守舟，孫 清，任文杰，孫 玲*

（1.山東省藥學科學院 山東省生物藥物重點實驗室，山東 濟南 250101；2.山東省生態環境監測中心，山東 濟南 250101）

索拉非尼（sorafenib）是一種新型多靶向性治療腫瘤的口服藥物，是全球公認的肝癌一線靶向藥物，具有雙重抗腫瘤作用，一方面，可通過抑制RAF/MEK/ERK信號傳導通路，直接抑制腫瘤生長；另一方面，又可通過抑制血管內皮生長因子受體（VEGFR）和血小板源生長因子受體（PDGFR）而阻斷腫瘤新生血管的形成，間接抑制腫瘤細胞生長，臨床上主要用于治療腎癌和肝癌[1-10]。

索拉非尼在合成過程中易殘留甲醇、丙酮、乙酸甲酯、叔丁醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲基異丁基酮和甲苯，根據《中國藥典》2020年版四部限量檢查法中殘留溶劑測定法[11]及國際人用藥品注冊技術協調會ICH Q3C（R8）規定，應對這些有機溶劑殘留進行測定。目前，國內外藥典尚未收載該品種，文獻報道的相關分析方法較少，有研究對甲苯磺酸索拉非尼中二氯甲烷等殘留溶劑進行測定[12-15]，富馬酸沃羅拉贊中乙酸乙酯等殘留溶劑進行測定[16]，由于生產工藝中使用有機溶劑種類不同，殘留溶劑測定方法不同，未見同時測定此8種殘留溶劑的報道。本文建立了頂空氣相色譜法準確測定索拉非尼中8種殘留溶劑的含量的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 7890B氣相色譜儀，7697A頂空進樣器（美國安捷倫科技有限公司）；氮氣（濟南德洋特種氣體有限公司，純度≥99.999 %）；XS-205型電子分析天平（十萬分之一天平，瑞士Mettler-Toledo公司）；氣相色譜柱（DB-624，30 m×530 μm×3 μm）。

1.2 試藥

索拉非尼（自制，批號：20210610，20210625，20210707，純度≥99.5 %），甲醇（批號：200803）、四氫呋喃（批號：201006）（均為色譜純，天津康科德，含量均≥99.9 %），丙酮（批號：20191209）、甲苯（批號：20180209）、乙酸甲酯（批號：20200801）（均為分析純，國藥集團，含量均≥99.9 %），叔丁醇（分析純，上海麥克林生化，含量≥99.0 %），乙酸乙酯（批號：200401，分析純，西隴化工，含量≥99.5 %），甲基異丁基酮（批號：191105，分析純，天津廣成，含量≥99.5 %），N-甲基吡咯烷酮（批號：20201105，分析純，天津科密歐，含量≥99.5 %）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：DB-624毛細管柱（30 m×530 μm×3 μm）；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持5 min，然后以10 ℃/min速率升溫至100 ℃，再以20 ℃/min速率升溫至200 ℃，保持5 min；進樣口溫度為230 ℃；采用氫火焰離子化檢測器，檢測器溫度為250 ℃；載氣為氮氣，流速為2.0 ml/min；頂空平衡溫度為80 ℃，平衡時間為20 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 空白溶劑 精密量取N-甲基吡咯烷酮2 ml，置入10 ml頂空瓶，密封。

2.2.2 供試品溶液 取索拉非尼約0.1 g，精密稱定，置入10 ml頂空瓶，精密加入2 ml N-甲基吡咯烷酮，緩緩振搖使其溶解，密封。

2.2.3 對照品溶液 分別精密稱取甲醇、丙酮、乙酸甲酯、叔丁醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲基異丁基酮、甲苯各適量置入于含有N-甲基吡咯烷酮的量瓶，并用N-甲基吡咯烷酮稀釋至刻度，制成每1 ml中含甲醇0.15 mg、丙酮0.25 mg、乙酸甲酯0.25 mg、叔丁醇0.25 mg、乙酸乙酯0.25 mg、四氫呋喃0.036 mg、甲基異丁基酮0.25 mg、甲苯0.044 mg的混合溶液，搖勻，精密量取此混合對照品溶液2 ml，置入10 ml頂空瓶，密封。

2.3 專屬性試驗

分別精密量取空白溶劑、對照品溶液和供試品溶液2 ml，置入10 ml頂空瓶，密封，按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結果表明，空白溶劑不影響樣品測定，對照品溶液中各主成分峰的出峰順序依次為甲醇、丙酮、乙酸甲酯、叔丁醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲基異丁基酮、甲苯，且各峰之間分離度均大于1.5，表明專屬性良好。

圖1 氣相色譜圖

2.4 線性關系考察

精密稱取甲醇61.15 mg、丙酮103.10 mg、乙酸甲酯103.47 mg、叔丁醇103.65 mg、乙酸乙酯104.21 mg、四氫呋喃15.08 mg、甲基異丁基酮104.69 mg和甲苯18.29 mg置入50 ml量瓶，加N-甲基吡咯烷酮溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液；分別精密量取1.0，2.0，3.0，5.0，7.0 ml，置入25 ml量瓶，加N-甲基吡咯烷酮溶解并定容至刻度，搖勻，作為線性1#～5#號溶液。分別精密量取2.0 ml，置入10 ml頂空瓶，密封。照上述色譜條件進行測定，以峰面積（Y）對濃度（X，μg/ml）繪制標準曲線。進行線性回歸，結果見表1。在表1所示線性范圍內，各溶劑峰面積與濃度呈良好的線性關系。

表1 各組分線性方程、線性范圍及相關系數

2.5 定量限和檢出限

取對照品溶液，加N-甲基吡咯烷酮進行稀釋，當甲醇、丙酮、乙酸甲酯、叔丁醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲基異丁基酮、甲苯的濃度分別為1.42，0.40，0.56，1.35，0.60，0.33，0.90，0.63 μg/ml時，其信噪比約為10，即為其定量限；當甲醇、丙酮、乙酸甲酯、叔丁醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲基異丁基酮、甲苯的濃度分別為0.43，0.12，0.17，0.41，0.18，0.10，0.27，0.19 μg/ml時，其信噪比約為3，即為其檢測限。

2.6 系統精密度試驗

精密量取6份線性1#溶液各2.0 ml，分別置入10 ml頂空瓶，密封，按上述色譜條件進行測定，記錄色譜圖，分別計算甲醇、丙酮、乙酸甲酯、叔丁醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲基異丁基酮、甲苯峰面積的RSD分別為2.34 %，1.32 %，1.13 %，2.99 %，1.63 %，2.32 %，2.89 %，2.91 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 準確度試驗

精密量取線性試驗項下貯備液2.4，3.0，3.6 ml（各3份），分別置入25 ml量瓶，加入N-甲基吡咯烷酮定容至刻度，搖勻，作為準確度試驗配樣溶液。精密稱取約0.1 g索拉非尼（9份，批號為20210610），每份加入上述配樣溶液各2 ml，振搖溶解后，作為準確度試驗供試品溶液。按上述殘留溶劑測定方法進行測定，扣除已知溶劑殘留量，以測得加入量與加入量計算回收率。結果見表2。

表2 回收率試驗結果（n=9）

2.8 耐用性試驗

取對照品溶液2 ml，分別置入10 ml頂空瓶，密封，在2.1項下色譜條件基礎上，分別調整程序升溫中初始溫度、載氣流速、檢測器溫度、進樣口溫度、程序升溫速率等條件，考察各峰之間分離度，均能完全分離，結果表明該法耐用性良好。

2.9 樣品測定

分別取2.2項下供試品溶液和對照品溶液各2 ml，分別置入10 ml頂空瓶，密封，進樣測定，按外標法以峰面積計算各有機溶劑殘留量，測定結果見表3。

表3 樣品測定結果（n=3）

3 討論

3.1 殘留溶劑的選擇

本品在合成和精制過程中，涉及到ICH規定限制使用和藥品GMP或其他質量要求限制使用的第二類溶劑四氫呋喃（限度0.072 %）、甲苯（限度0.089 %）、N,N-二甲基乙酰胺（限度0.109 %）、甲醇（限度0.3 %），第三類溶劑丙酮（限度0.5 %）、甲基異丁基酮（限度0.5 %）、乙酸乙酯（限度0.5 %）。同時，在合成過程中使用叔丁醇鉀，可能生成叔丁醇；合成過程中同時使用乙酰氯和甲醇，可能生成乙酸甲酯，故對叔丁醇（限度0.5 %）和乙酸甲酯（限度0.5 %）進行檢測。

3.2 色譜柱的選擇

分別選用DB-INNOWAX、HP-5、DB-624及DB-17毛細管柱進行測定，通過對比結果，采用DB-624作為測定色譜柱，同時對程序升溫進行優化，最終采用初始溫度40 ℃，保持5 min，然后以10 ℃/min速率升溫至100 ℃，再以每 20 ℃/min速率升溫至200 ℃，保持5 min，在此條件下，各組分峰形較好，分離度符合要求。

3.3 瓶平衡溫度及平衡時間的選擇

本試驗考察了頂空瓶在不同平衡溫度（70，80，90，100 ℃）和不同平衡時間（10，20，30，45 min）條件下各主成分峰峰面積，結果表明，平衡溫度為80 ℃，平衡時間為20 min時，各峰峰面積達到最大值。溫度繼續升高、平衡時間繼續延長，各主成分峰峰面積不再增加，最終選擇平衡溫度為110 ℃，平衡時間為20 min，在此條件下，即達到測定效果，又能節約成本。

本實驗首次采用頂空毛細管氣相色譜法測定索拉非尼中8種殘留溶劑的含量，經過方法學驗證和樣品的測定，結果表明，所建立的方法靈敏度高、操作簡便、準確可靠，能準確測定索拉非尼中8種殘留溶劑的含量，為提升索拉非尼的質量控制標準和全面評價其內在產品質量提供了依據。