基于HPLC指紋圖譜對紅茴香和八角果實不同部位中莽草酸含量比較分析

李 霞，黃東萍，王仕寶 ，趙苗苗，李崇勇，何志鵬，崔艷麗

（1.漢中職業技術學院 農林技術與生物工程學院，陜西 漢中 723000；2.漢中食品藥品檢驗檢測中心，陜西漢中 723000；3.漢中職業技術學院 藥學院，陜西 漢中 723000；4.漢中職業技術學院 秦巴山區藥（食）用植物研究所，陜西 漢中 723000；5.陜西國際商貿學院 醫藥學院，陜西 西安 712046；6.漢中職業技術學院 基礎課教學部；陜西 漢中 723000）

紅茴香（Illicium henryi Diels）來源于木蘭科八角屬，又名紅毒茴，是中國特有植物；生于海拔300～2200 m的丘陵或山地溝谷、溪邊濕潤常綠闊葉林中或林緣[1]，主產于陜西、甘肅、云南、廣西等地。在中藥資源普查中發現，紅茴香在陜南區域分布廣泛，在民間通常替代八角茴香作為調味品食用。

莽草酸（shikimic acid，簡稱SA），作為一種芳香族中間代謝產物，是合成抗癌藥物和甲型H1N1流感病毒藥物奧司他韋的前體原料[2-3]。莽草酸有較強的生物活性，作用機制體現在影響花生四烯酸代謝，抑制血小板聚集和腦血栓形成；還有抗炎、鎮痛作用[4-5]。莽草酸在木蘭科八角屬植物的果實等部位中廣泛分布，因此，八角果實中莽草酸的提取分離、含量檢測等方面文獻報道較多，但在其它部位中莽草酸檢測和資源開發利用研究相對較少。基于第四次全國中藥資源普查和傳統知識調查，在陜南巴山地區，野生紅茴香分布較廣，但資源的開發利用相對單一，僅將紅茴香果實作為調味品自采自用，其他部位如葉子、皮類等資源均未充分利用。本文主要探究HPLC測定紅茴香不同部位中莽草酸含量，并與市購食用八角的不同部位中莽草酸含量進行比較分析，結合15批不同來源樣品構建中藥指紋圖譜，針對莽草酸含量進行比較分析和相似度評價，得出樣品中莽草酸含量差異性變化，從而為該區域紅茴香資源的開發利用提供一定參考。

1 儀器、材料與試藥

高效液相色譜儀（島津LC-20AT），輸液泵（LC-20AT），二極管陣列檢測器（SPD-M20A）；超聲波清洗器（KQ-800E）；粉碎機（HL-500A型高速多功能粉碎機）；電子天平（MS105DU，d=0.01 mg，梅特勒-托利多）等。

莽草酸對照品：購于北京華工科創生物技術有限公司（批號：AF8102671，純度：98 %）。試驗材料野生紅茴香于2020年6月～10月采自陜西寧強、南鄭和鎮巴，經漢中職業技術學院秦巴山區（食）藥用研究所王仕寶副教授鑒定為木蘭科植物紅茴香 Illicium henryi Diels，自然干燥后保存備用。八角材料購于漢中農用市場，總計3批；在試驗前對其中一批按照果殼、籽、果柄進行分類備用。方法學考察采用編號為HHX03的樣品，樣品編號信息見表2。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hedera NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（用磷酸調pH值3.5）（40:60）；流速：1 ml/min；檢測波長：210 nm；進樣量：20.0 μl。在該條件下，對照品與樣品的色譜圖見圖1（A、B）。

圖1 紅茴香對照品與樣品色譜圖

2.2 溶液制備

對照品貯備液：取莽草酸對照品適量，精密稱定，置入50 ml量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻作為對照品貯備液（質量濃度：560.56 μg/ml）。

供試品溶液的制備：取干燥后的紅茴香果實、果殼（不含籽）、葉、皮及八角果實，依次粉碎，過2號篩，取0.25 g精密稱定，置入100 ml量瓶，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液分別作為供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 粉碎粒度考察 取供試品（HHX03）粉碎后分別過1號篩（10目），2號篩（24目），3號篩（50目），4號篩（65目）。比較不同過篩粒度，結果表明，粉碎粒度為過2號篩較適宜。

2.3.2 提取溶劑考察 供試品（HHX03）粉碎后過2號篩，分別用50 %乙醇、95 %乙醇、50 %甲醇、甲醇、水溶液為溶劑進行超聲提取。比較不同的提取溶劑的提取得率，結果表明，提取溶劑以甲醇較適宜。

2.3.3 提取時間考察 供試品（HHX06）粉碎后過2號篩，以甲醇為提取劑，分別采用超聲10，20，30，40 min提取，計算莽草酸得率。結果表明，超聲30 min較適宜。

2.3.4 線性范圍考察 線性范圍考察 精密量取對照品貯備液0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 ml，分別置入50 ml量瓶，用甲醇稀釋至刻度并搖勻，制成濃度分別為5.61，11.21，22.42，56.06，112.11 μg/ml的溶液，及濃度為560.56 μg/ml 的對照品貯備液，作為系列標準溶液，分別注入液相色譜儀，測定峰面積，以莽草酸的質量濃度為橫坐標X，以峰面積值為縱坐標Y，得回歸方程Y=50 943.4X-27 400.6，r=0.9997。結果表明：莽草酸進樣量在5.61～560.56 μg/ml與峰面積呈良好的線性關系。

2.3.5 精密度試驗 分別制備供試品（HHX03）6份，按照2.2項方法制備供試品溶液，每次進樣量20.0 μl，根據峰面積計算含量，其RSD=1.6 %，表明方法具有較好的重復性。

2.3.6 供試品溶液穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于 0，6，12，24，48 h進樣測定，記錄峰面積。結果峰面積RSD=0.8 %，表明供試品溶液在48 h內穩定。

2.3.7 加樣回收率試驗 分別精密稱取6份已知含量的供試品（HHX03）適量，精密加入對照品貯備液適量，按2.2項方法制備供試品溶液，測定并計算回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率（n=6）

2.4 樣品含量測定

收集的15批樣品分別依2.2項下方法制備供試品溶液，每次進樣量20.0 μl，計算含量，樣品各成份的含量見表2。

表2 樣品信息及含量測定值

2.5 中藥指紋圖譜相似度評價

參照文獻，將15批樣品的HPLC指紋圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012 A版），分別對各批次樣品指紋圖譜進行匹配，得出相應的對照圖譜，以生成的對照圖譜（R）為對照，通過設參照圖譜、多點校正、自動匹配和采用中位數計算相似度，范圍在0.048～0.999之間，結果表明，15批樣品莽草酸含量差異較大。所有樣品和對照品HPLC指紋圖譜分別見圖2和圖3。

圖2 15批樣品HPLC指紋圖譜

圖3 對照品HPLC指紋圖譜

表3 樣品相似度數據

3 討論

3.1 結合文獻[6-7]及中國植物志[8]發現，紅茴香和紅毒茴是兩個不同的種類，紅茴香Illicium henryi Diels又稱紅毒茴、披針葉茴香、莽草（古名）等；紅毒茴 Illicium lanceolatum A.C.Smith.又稱紅茴香、披針葉茴香、莽草等。另外，八角屬（Illicium）植物部分種類具有藥用價值[9]。八角屬植物中的莽草酸，具有抗病毒、抗腫瘤和對心血管系統的作用[10]，還可作為組織再生劑，促進傷口愈合和增強真皮重建作用[11]。本文針對15批樣品進行分析，根據莽草酸含量檢測比較：果殼（不含籽）＞果實（含籽）＞葉＞莖皮。分析原因，主要與紅茴香不同部位、不同產地和不同采收樣品的時間有關。此外，以八角為研究材料，得出莽草酸含量其果殼（不含籽）＞果柄＞籽。但是，從比較野生的紅茴香和栽培八角的不同基原進行，同一部位果實（含籽）中莽草酸含量檢測結果，得出紅茴香（117.17，113.26，96.14 mg/g）＞八角茴香（90.03，73.57，68.69 mg/g）。最后，由于本次收集樣品較少，故以上數據不能完全反映不同部位中莽草酸含量高低，因此有待今后對紅茴香不同部位、不同季節中莽草酸累計含量值進行詳細研究。

3.2 藥材中有效成分的提取方法多樣，本研究紅茴香樣品（葉子、果實、果殼、葉、莖皮）在前期試驗中探究了回流、超聲、浸漬、微波輔助和索氏提取等方法，通過比較紅茴香葉中莽草酸提取得率，選擇了超聲提取方法較為適宜。另據文獻報道[12]，用二極管陣列檢測器在一定條件下，分析了莽草酸對照品色譜峰及樣品中目標組分對應色譜峰的紫外光譜，確定莽草酸在210 nm處有最大吸收。因此，本研究考慮選擇210 nm作為檢測波長，既可對目標成分進行準確分析又可將相關物質有效檢出。結合流動相優化，確定乙腈-水（用磷酸調pH值3.5）（40:60），色譜峰分離較好，拖尾現象較少。

3.3 中藥指紋圖譜作為中藥質量領域的一種常用手段，具有一定優點，可全面評價中藥的化學成分和藥品質量，為中藥多指標質量評價提供新的思路。依據《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012 A版），按照檢測結果的HPLC圖譜，通過標定共有的特征峰，同時結合參照圖譜、多點校正、自動匹配和采用中位數計算相似度，最后構建所有樣品的HPLC指紋圖譜[13-14]。本研究結果表明，15批樣品中莽草酸含量差異很大。另外，八角果實不同部位（帶籽果實、果殼、籽和果柄）含量為41.36～92.73 mg/g。以上結果可為紅茴香和八角果實的不同部位進行莽草酸含量測定和質量評價提供參考依據。