超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定蜂花粉中10種真菌毒素

李 莉，李 碩

（1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.中國計量科學研究院，北京 100029）

蜂花粉是由蜜蜂將采集的花粉粒摻入少量的花蜜和自身腺體分泌物混合而成的花粉團[1-2]，其中含有多種重要的營養成分，如蛋白質、脂質、碳水化合物、維生素和礦物質[3-4]。除了能提供豐富的營養外，蜂花粉還具有抗炎、抗疲勞、增強免疫力等功能特性[5-7]，自古以來就被當做營養和保健品食用。由于花粉的含水量、水活度和pH值非常適宜微生物如細菌、真菌和酵母等的繁殖，是天然的培養基，因此蜂花粉在采集、儲存和銷售過程中很容易滋生霉菌而有可能產生真菌毒素[2,8-9]。真菌毒素有較高的生物毒性，如致癌、致畸和肝腎毒性等，攝入被真菌毒素污染的食品會對人類健康造成極大危害[10-13]。

目前國內外文獻報道中，有關蜂花粉中真菌毒素的測定方法主要是液相色譜質譜聯用技術，涉及的真菌毒素種類多為單一種類如赭曲霉毒素A或黃曲霉毒素B族和G族等[14-16]，尚未有多種真菌毒素同時測定的報道。蜂花粉中真菌毒素的提取和凈化方法多采用免疫親和柱凈化技術，但由于免疫親和柱檢測專屬性較高，且操作繁瑣，不適用于多種毒素的提取凈化，不利于大樣本量的快速篩查。QuEChERS快速樣品前處理技術可以實現多種雜質的快速高效去除，具有簡便快速的特點，近年成為食品中真菌毒素檢測的常用方法[17-26]。本研究利用改良后的QuEChERS前處理技術，結合超高效液相質譜檢測方法，建立了同時測定蜂花粉中多種真菌毒素的檢出方法，可實現大批量樣品高通量快速篩查。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AL 204分析天平（美國Mettler Toledo公司）；Vortex Genie 2渦旋混勻器（美國Scientific Industries公司）；CF 16RXII離心機（日本日立公司）；LC 20AC-LCMS 8060超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜儀（日本島津公司）；KQ-3200DE超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

伏馬毒素B1、B2、B3（FB1、FB2、FB3）混合標準溶液（50 μg/ml，青島普瑞邦公司）；黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）混合標準溶液（10 μg/ml，青島普瑞邦）；赭曲霉毒素A、B、C（OTA、OTB、OTC）混合標準溶液（10 μg/ml，青島普瑞邦）；乙腈（色譜純，德國 Merck）；甲酸（質譜級，Fisher Scientific公司）；乙酸（質譜級，Fisher Scientific）；實驗用水均為超純水；MPFCQuEChERS超濾型凈化柱（高脂類，北京綠綿）；Waters DisQuE 凈化管（2 ml，美國Waters）；QuEChERS提取鹽包（4 g MgSO4和1 g NaCl，北京綠綿）；蜂花粉樣品購自網絡平臺。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫 Poroshell 120 SB-C18色譜柱（100 mm× 2.1 mm，2.7 μm）；流動相A：0.1 %甲酸水溶液，流動相B：0.1 %甲酸乙腈溶液，梯度洗脫程序為：0～1 min，10 %～20 % B；1～9 min，20 %～40 % B；9～12 min，40 %～95 % B；12～14 min，95 % B；14～14.1 min，95 %～10 % B；14.1～16 min，10 % B。柱溫40 ℃，流速：0.3 ml/min，進樣量：5 μl。

2.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（electrospray ion，ESI），電離模式：正離子模式；檢測方式：多反應監測（multi reaction monitoring，MRM）模式；接口電壓4.0 kV；接口溫度300 ℃；碰撞氣為氬氣，霧化氣流量 3 L/min，干燥氣流量10 L/min，加熱氣流量10 L/min，其他質譜參數見表1。

表1 MRM模式下10種毒素的質譜參數

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合標準溶液的配制 分別準確移取伏馬毒素B1、B2、B3混合標準溶液0.4 ml，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合標準溶液1 ml，赭曲霉毒素A、B、C混合標準溶液1 ml置入10 ml，棕色量瓶，用50 %乙腈水溶液定容至刻度，配制成伏馬毒素B1、B2、B3質量濃度為2 μg/ml，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和赭曲霉毒素A、B、C質量濃度為1 μg/ml的混合標準儲備溶液，-20 ℃避光保存。臨用時以空白蜂花粉基質提取液將上述標準溶液稀釋為系列混合標準工作液。

2.3.2 供試品溶液的制備 準確稱取粉粹過篩后的蜂花粉樣品2.5 g置入50 ml聚丙烯離心管，加入 20 ml乙腈-水-甲酸溶液（75:20:5，v/v/v），旋渦混勻30 s，室溫下超聲提取30 min。隨后加入4 g MgSO4和1 g NaCl，劇烈振搖1 min，10 000 r/min 離心5 min。取上清1 ml，過MPFC-QuEChERS高脂類超濾型凈化柱凈化后，經0.22 μm聚四氟乙烯濾膜過濾，續濾液作為待測溶液。

2.4 線性范圍考察

按2.3.2項步驟提取蜂花粉空白基質溶液，將混合標準溶液配制成系列濃度的基質標準溶液上機測定，以目標組分的質量濃度為橫坐標，定量離子的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到相關系數和回歸方程，見表2。結果表明，10種真菌毒素在各自的線性范圍內線性關系良好，相關系數r在0.9990～0.9999范圍內。

2.5 檢出限和定量限

根據加標回收試驗結果，以3倍信噪比確定10種化合物的檢出限為1～1.8 μg/kg，以10倍信噪比確定定量限為3～6 μg/kg，結果見表2。

2.6 基質效應

基質效應（matrix effect，ME）是指由于脂類、鹽類等內源性物質或表面活性劑、緩沖鹽等外源性物質與目標化合物同時進入質譜時，對目標化合物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結果的準確性，按照對結果影響不同，分為基質增強效應和基質抑制效應[27-29]。本實驗通過計算相同濃度下，空白基質加標溶液中10種化合物的峰面積與純溶劑標準溶液對應化合物峰面積的比值，考察基質效應。結果表明，除伏馬毒素B1、B2、B3外，其他7種毒素呈現不同程度的離子抑制作用（基質效應在29.2 %～70.5 %之間）（見表2）。為了減少基質效應的影響，實驗采取基質匹配標準曲線校正的方法進行定量分析。

表2 10種真菌毒素的回歸方程、相關系數、線性范圍、檢出限及定量限

2.7 回收率和精密度

向蜂花粉空白樣品中加入低、中、高3個濃度水平的10種真菌毒素標準溶液，每個添加水平重復測定6次，計算加標回收率和精密度（見表3）。10種毒素的平均回收率在71.3 %～106.5 %之間，相對標準偏差（RSD）為1.0 %～9.5 %。

表3 不同添加水平下的回收率和精密度（n=6）

2.8 實際樣品檢測

按照本研究建立的方法對從網絡購物平臺購買的25批蜂花粉樣品進行測定，25批蜂花粉中均未檢出黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、B、C和伏馬毒素B1、B2、B3。對檢測結果分析，推測可能由于購買的樣品產地多為中國北方區域，氣候相對干燥，不利于霉菌的生長或孢子的產生，未生成毒素，這也和文獻報道的結果一致[16]。

3 討論

3.1 色譜條件的優化

本實驗考察了0.1 %甲酸溶液-乙腈體系和5 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈體系兩種流動相對10種毒素的洗脫分離效果，發現以0.1 %甲酸溶液-乙腈體系為流動相時得到的基線平穩，噪音小，目標化合物的響應更高。因此選擇0.1 %甲酸溶液-乙腈體系為流動相進行梯度洗脫。10種真菌毒素的標準溶液MRM總離子流圖見圖1。

圖1 10種真菌毒素的總離子流圖

3.2 質譜條件的優化

由于10 種真菌毒素均屬于極性化合物，采用電噴霧離子源時都有較高的響應，因此選用ESI 模式。對10種真菌毒素分別在正離子和負離子模式下進行全掃描，所有化合物在正離子模式下響應更高，因此選擇采用正離子掃描方式。通過液質聯用儀分析軟件的自動質譜參數優化模式，對目標化合物在多反應監測模式（MRM）下的定性、定量離子及相應的電壓和碰撞能進行優化，即可得到最優的質譜條件。

3.3 樣品提取溶液的選擇

蜂花粉基質較復雜，富含蛋白質、脂類、黃酮類化合物和色素等成份，提取溶劑直接影響目標化合物的提取效率。實驗通過空白基質加標的方式，考察了乙腈、75 %乙腈溶液和50 %乙腈溶液3種提取溶液的提取效果。結果表明，4種黃曲霉毒素和3種赭曲霉毒素用純乙腈或75 %乙腈溶液提取，回收率較好，用50 %乙腈溶液提取時回收率小于40 %；3種伏馬毒素用75 %乙腈溶液或50 %乙腈溶液時，回收率大于70 %，用純乙腈提取時回收率小于50 %。綜合考慮后選擇75 %乙腈溶液作為提取溶劑。

由于伏馬毒素類化學結構中含有羧基，水溶性強，對酸敏感，提取溶劑中加入適量的酸可提高回收率。對含有不同濃度甲酸或乙酸的提取溶液進行考察，結果見圖2。當提取液中甲酸含量為5 %時，10種真菌毒素的回收率在70 %～120 %之間，滿足回收率實驗要求。因此最終選擇乙腈-水-甲酸溶液（75:20:5，v/v/v）作為樣品的提取溶劑。此外，在提取體系中加入適量MgSO4和NaCl可促進乙腈和水相更好的分層，在鹽析作用下容易從水相中萃取極性較弱的毒素，同時還能減少干擾雜質的引入有利于樣品溶液的進一步凈化。

圖2 不同提取溶液對10 種真菌毒素的提取效率（n=6）

3.4 凈化方式的選擇

蛋白質、脂類、黃酮類物質和色素是松花粉中主要的基質干擾，目前常用的真菌毒素的凈化方式多采用免疫親和柱或富集濃縮型固相萃取小柱（SPE）的方法，免疫親和柱雖然特異性強，但是往往只能針對特定種類的毒素，且價格昂貴，操作繁瑣；傳統固相萃取小柱需要經過活化、上樣、淋洗、洗脫等步驟，所用有機試劑較多且耗時較長，這兩種凈化方式均不適用于多種真菌毒素的快速篩查。

本文采用空白基質加標的方式，向空白蜂花粉基質中添加2種濃度的標準溶液，經提取溶液提取后，分別采用Waters DisQuE 凈化管和綠綿MPFC-QuEChERS凈化，考察2種不同的QuEChERS凈化方法的凈化效率。結果表明，經MPFC-QuEChERS凈化后的10種毒素回收率為71.3 %～101.9 %，經DisQuE 凈化后黃曲霉毒素和赭曲霉素回收率為81.1 %～99.8 %，滿足回收率要求，但是3種伏馬毒素的回收率均低于50 %。因此實驗最終選擇MPFC-QuEChERS凈化柱進行樣品的凈化（見表4）。

表4 不同凈化方法下10 種毒素的回收率（n=3）

4 結論

本研究建立的蜂花粉中10種真菌毒素的檢測方法和傳統免疫親和柱凈化方法相比，具有操作簡便，快捷高效，適用于不同種類毒素同時檢測的優點，具有較高的靈敏度和準確性，適用于大批量蜂花粉樣品中真菌毒素的快速篩查分析。