投喂頻率、水溫和養殖密度對大口黑鱸生長性能、腸道結構和肝臟生長相關基因表達量的影響

黃文慶，黃 龍，賴明建，李湘妮，陳佳佳，劉鳳坤，徐志雄，胡俊茹

（1.廣東省農業科學院動物科學研究所/農業農村部華南動物營養與飼料重點實驗室/廣東省動物育種與營養公共實驗室/廣東省畜禽育種與營養研究重點實驗室，廣東 廣州 5106 40；2.廣州飛禧特生物科技有限公司，廣東 廣州 510640；3.佛山市農業科學研究所，廣東 佛山 528145；4.北部灣大學海洋學院/廣西北部灣海洋生物多樣性養護重點實驗室，廣西 欽州 535011）

【研究意義】大口黑鱸又稱加州鱸，隸屬于鱸形目（Perciformes）鱸亞目（Porcoidei）太陽魚科（Cehtrachidae）黑鱸屬（Micropterus），原產于美國加利福尼亞州密西西 比河流域［1］，具有廣溫性、耐低氧［2］、長速快、易捕獲、無肌間刺等生物學特性。大口黑鱸已成為我國大宗特種淡水經濟魚類之一，因其肉質鮮美和營養價值高等 優點［3］而廣受消費者喜愛，在國內具有廣闊的消費市場。近幾年大口黑鱸養殖規模和年產量快速擴增，我國大口黑鱸養殖區域主要集中分布在廣東、江蘇、浙江、江西、四川和福建等地［3］。據統計，2021 年全國大口黑鱸養殖產量達50 萬t 以上，其中廣東占比近60%。隨著大口黑鱸營養需求與飼料配方技術研究的不斷深入，通過開發優質實用型全價配合飼料，推廣科學的食性馴化和飼料投喂技術，有望替代投喂冰鮮雜魚的養殖模式。

【前人研究進展】人工養殖條件下魚類的生長受環境因素和養殖管理因素的雙重作用。水溫是影響魚類攝食、生長、繁殖、新陳代謝及滲透壓調節等機體活動的關鍵環境因素之一。不同品種的魚類適宜在不同水溫條件下生長。草魚的最適生長水溫為28～32 ℃［4］，鯉魚更適宜在20 ℃水溫條件下生長［5］。陳思等［6］比較分析了17～37 ℃水溫條件下龍虎斑幼魚的生長情況，認為33 ℃水溫條件下龍虎斑幼魚生長最快。大口黑鱸的最適生長水溫在20～30 ℃［7］。而養殖密度、投喂頻率通常被認為是集約化人工養殖模式下影響魚類產量的重要管理因素［8-9］。謝蘇明等［10］研究認為，大口黑鱸在工程化循環水養殖條件下的適宜投喂頻率為2 次/d。倪金金等［11］研究發現，大口黑鱸放養密度以0.2～0.4 kg/m3為宜，有利于促進魚的生長和提高肝臟生長基因的表達量。王裕玉等［12］認為，在養殖前期的幼魚階段采取高密度養殖方式不影響大口黑鱸的生長，養成至大規格魚種階段再降低密度可減少應激引起的生長變緩。

【本研究切入點】大口黑鱸在養殖過程中，往往受到投喂頻率、水溫和養殖密度的交互影響，目前有關三因素對大口黑鱸交互作用的研究未見報道。在一定水溫范圍內，養殖過程中投喂頻率和養殖密度與水溫往往呈正相關；但在過高的水溫范圍，投喂頻率和養殖密度與水溫呈負相關，而投喂頻率與養殖密度呈正相關，尤其是在魚苗的標粗階段。研究發現，魚類生長主要取決于攝食率和飼料轉化率［13］，在適宜的水溫范圍內，魚類對營養物質的消化和吸收與水溫呈正相關［14］，而適當提高養殖密度和投喂頻率，可提高魚類的生長速度和單位養殖產量［11,15］。本試驗研究不同水平的投喂頻率、水溫和養殖密度對大口黑鱸的交互影響，除比較生長性能指標的差異外，還基于腸道組織發育和肝臟生長相關基因表達量作進一步探討。【擬解決的關鍵問題】通過研究不同投喂頻率、水溫和養殖密度對大口黑鱸生長性能、腸道組織結構和肝臟生長激素（GH）、類胰島素樣生長因子-1（IGF-1）基因表達量的影響，從而確定適宜的投喂頻率、水溫和養殖密度，為大口黑鱸高效養殖提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大口黑鱸魚苗購自陽山利陽水產科技有限公司。魚苗在廣東省農業科學院動物科學研究所水泥池中暫養馴化2 周，每天早、晚投喂2 次，待魚苗健康穩定且攝食正常后，挑選規格均勻、體格健康、平均體質量為17 g 左右的魚苗作為試驗對象。試驗期間各處理均投喂相同的大口黑鱸商品配合飼料（購自佛山順德區豐華飼料實業有限公司），飼料含粗蛋白質50.68%、粗脂肪10.15%、水分8.46%、粗灰分12.57%、鈣44.81%和總磷2.82%。

1.2 試驗設計

試驗采用3 因素（投喂頻率、水溫和養殖密度）2 水平（2×2×2）交互設計8 個處理（表1），各處理4 個重復。投喂頻率，設 2 次/d（8:00、20:00）、3 次/d（8:00、14:30 和20:00）；水溫，設25、30 ℃；養殖密度，設25、35 尾/缸（150 升）。投喂頻率、水溫和養殖密度的水平設置參考人工養殖常見管理模式和水質條件。

表1 試驗處理Table 1 Experimental treatment

養殖試驗于2021 年6 月在廣東省農業科學院動物科學研究所室內溫控循環水養殖系統中開展，系統缸水體為150 L，每4 個缸體配備一套獨立循環過濾裝置。采用飽食方式投喂，并根據各處理攝食情況調整投喂量。養殖試驗期間為自然光照，水溫根據各處理目標值設定，氨氮濃度＜0.02 mg/L，亞硝酸鹽濃度＜0.05 mg/L，溶氧濃度＞5.0 mg/L，pH 7.8～8.2。養殖試驗為期8 周。

1.3 樣品采集和檢測分析

養殖試驗結束前禁食24 h，稱量每缸大口黑鱸的總質量，并統計每缸的存活尾數，計算生長性能指標。從每缸中選取接近均重的6 尾魚，測量體長，稱量體質量、腹脂質量，計算形體指標。計算公式如下：

特定生長率（SGR,%/d）=100×（ln 終末均重-ln 初始均重）/試驗天數；

攝食率（FR，g/尾）=攝食總量/（初始尾數+末尾數）/2；

成活率（SR，%）=100×終末魚的尾數/初始魚的尾數；

飼料系數（FCR）=攝食量/（終末總質量+死亡總質量-初始總質量）；

肥滿度（CF，%）=100×體質量/體長3；

腹脂率（AFY，%）=100×腹脂質量/體質量。

采集3 尾魚的前腸樣品，置于福爾馬林固定液中保存，用于腸道組織結構測定；采集肝臟樣品，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于GH和IGF-1基因表達量測定。

腸道組織切片：通過脫水、包埋、切片、染色、封片后使用PANNORAMIC 全景切片掃描儀進行觀察，通過Image-Pro Plus 6.0 分析軟件測定絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度。

肝臟GH和IGF-1基因的相對表達量測定：根據TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒方法提取肝臟總RNA，通過電泳檢測總RNA 的完整性。采用TaKaRa PrimeSciptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉錄試劑盒合成cDNA（-20 ℃保存待用）。應用 Primer Premier 5.0 設計引物，根據NCBI 獲得的大口黑鱸轉錄組數據及其相關基因的全長序列設計特異性引物，所有引物（表2）均由廣州興譽生物科技有限公司合成。

表2 實時定量 PCR 引物Table 2 Real-time quantitative PCR primers

GH、IGF-1、18S和β-actin基因的表達量采用 TaKaRa TB GreenTMFast qPCR Mixc 進 行RTPCR 反應，然后采用 SYBR Green Ⅰ嵌合熒光法進行實時定量PCR 擴增反應，反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s、58 ℃復性10 s，進行40 個循環；熔解反應條件為65～95 ℃。反應結束后確認 RT-PCR 的擴增曲線和熔解曲線。以β-actin和18S為內參，對得到的各樣品Ct值進行均一化處理，以投喂頻率2 次/d 處理的各基因mRNA 水平為基準，應用2-ΔΔCt法確定不同頻率處理大口黑鱸的mRNA 相對表達量。

1.4 數據統計分析

采用 SPSS22.0 軟件對所有組間數據進行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan 氏多重比較，用一般線性模型單變量方法分析投喂頻率、水溫和養殖密度的主效應以及交互效應。

2 結果與分析

2.1 投喂頻率、水溫和養殖密度對大口黑鱸生長性能的影響

單因素方差分析結果（表3）顯示，處理Ⅴ的大口黑鱸特定生長率比處理Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ，分別顯著提高10.16%、10.61%、9.27%和8.40%；攝食率比處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ分別顯著提高10.94%、27.02%、26.45%和17.38%，飼料系數比處理Ⅳ、Ⅶ、Ⅷ，分別顯著降低7.87%、8.89%和8.89%，肥滿度高于其他各處理，且與處理Ⅲ、Ⅶ差異顯著，腹脂率與其他處理相比差異不顯著，存活率各處理間均無顯著差異。主效應分析結果（表3）顯示，僅養殖密度對攝食率的影響和投喂頻率對肥滿度的影響達顯著水平。交互效應對肥滿度影響達顯著水平，對特定生長率、攝食率、飼料系數、存活率和腹脂率影響均未達顯著水平。

表3 投喂頻率、水溫和養殖密度對大口黑鱸生長性能的影響Table 3 Effects of feeding frequency,water temperature and breeding density on growth performance of largemouth bass

2.2 投喂頻率、水溫和養殖密度對大口黑鱸腸道組織結構的影響

單因素方差分析結果（表4）顯示，處理Ⅴ的大口黑鱸腸道絨毛高度比處理Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ，分別顯著提高27.12%、19.05%和27.12%。處理Ⅰ絨毛寬度比處理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ分別顯著提高25.00%、36.36%、25.00%、25.00%、15.38%和25.00%；處理Ⅴ絨毛寬度比處理Ⅲ顯著提高27.27%。處理Ⅰ、Ⅲ肌層厚度比處理Ⅶ分別顯著提高46.15%和30.77%，其他各處理間均無顯著差異。主效應和交互效應對腸道絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度的影響均未達顯著水平（表4）。

表4 投喂頻率、水溫和養殖密度對大口黑鱸腸道組織結構的影響Table 4 Effects of feeding frequency,water temperature and breeding density on intestinal tissue structure of largemouth bass

2.3 投喂頻率、水溫和養殖密度對大口黑鱸肝臟GH 和IGF-1 基因表達量的影響

單因素方差分析結果（表5）顯示，大口黑鱸肝臟的GH和IGF-1基因表達量存在顯著差異，但處理Ⅳ、Ⅷ以及處理Ⅲ、Ⅵ的GH 基因表達量組間差異不顯著，處理Ⅲ、Ⅵ以及處理Ⅳ、Ⅶ的IGF-1基因表達量差異不顯著，GH基因表達量大小依次為處理Ⅰ＞Ⅴ＞Ⅱ＞Ⅵ＞Ⅲ＞Ⅶ＞Ⅳ＞Ⅷ，IGF-1基因表達量大小依次為處理Ⅴ＞Ⅰ＞Ⅶ＞Ⅳ＞Ⅵ＞Ⅲ＞Ⅷ＞Ⅱ。主效應和交互效應對肝臟GH和IGF-1基因表達量影響均未達顯著水平（表5）。

表5 投喂頻率、水溫和養殖密度對大口黑鱸肝臟GH 和IGF-1 基因表達量的影響Table 5 Effects of feeding frequency,water temperature and breeding density on hepatic GH and IGF-1 gene expression levels of largemouth bass

3 討論

3.1 投喂頻率、水溫和養殖密度對大口黑鱸生長性能的影響

養殖過程中魚類攝食往往受到水溫、養殖投喂頻率和養殖密度等外部條件的影響。有研究報道投喂頻率影響魚類的攝食率和飼料轉化率［16］，魚類的攝食率與投喂頻率在一定范圍內呈正相關，對代謝速度快的肉食性魚類可適當提高投喂頻率，提高魚類的攝食率和飼料轉化率，增加營養物質的攝入，從而促進魚類生長［17］。但過高的投喂頻率，易造成營養物質消化吸收不完全排出體外，且頻繁的攝食活動會增加魚體的能量消耗，反而不利于魚類生長［18］。研究發現，在飽食投喂的實驗條件下，增加投喂頻率可提高軍曹魚［17］和黃蓋鰈［19］的采食量和生長速率，但謝蘇明［18］研究發現，60 d 的養殖周期以2～4 次/d 的頻率投喂，大口黑鱸的末均重、增重率和特定生長率無顯著差異，2 次/d 的投喂頻率足以滿足大口黑鱸生長發育的營養需求。檀晨曦［20］研究認為，養殖花鰻鱺的最優投喂頻率為2 次/d。

魚類屬于變溫動物，水溫是其生長發育的重要環境因子之一［21］。據報道大口黑鱸屬于溫水性魚類，其最適水溫為15～30 ℃，最佳生長水溫為20～25 ℃［22］。楊斯琪等［23］研究發現，幼魚階段的大口黑鱸的最適生長水溫為21～25 ℃，與本研究結果基本一致。養殖密度是決定魚類生長速度和單位產量的主要因素之一［24］，適當提高單位養殖密度，可提高單位產量和養殖效益。但過度的高密度養殖對魚類形成擁擠脅迫，反而對魚類的生長起抑制作用［20］。本試驗結果表明，主效應僅投喂頻率對肥滿度和養殖密度對攝食率的影響達顯著水平，投喂頻率、養殖密度對其他生長性能和形體指標的影響未達顯著水平，而水溫對生長性能特定生長率、攝食率、飼料系數、存活率以及形體指標的肥滿度和腹脂率均無顯著影響；交互效應均僅對肥滿度有顯著影響，對特定生長率、攝食率、飼料系數、存活率和腹脂率均無顯著影響。單因素方差分析結果顯示，處理Ⅴ（3 次/d，25 ℃，25 尾/缸）大口黑鱸的特定生長率、攝食率、飼料系數顯著優其他各處理，其次為處理Ⅰ（2 次/d，25 ℃，25 尾/缸），處理Ⅴ與處理Ⅰ相比，生長性能各指標無顯著差異，說明本試驗條件下，大口黑鱸幼魚最適宜投喂頻率為2～3 次/d，水溫為25 ℃，養殖密度為25 尾/缸，這一結果與謝蘇明［18］和楊斯琪等［23］的報道結果基本一致。

3.2 投喂頻率、水溫和養殖密度對大口黑鱸腸道組織結構的影響投喂頻率

腸道是魚類運輸食物和營養物質消化吸收的重要場所［25］。在魚類營養學領域，一般通過研究腸道組織結構來評估魚類對營養物質的消化吸收能力，從而間接反映魚類的生長情況。腸道絨毛長度、絨毛寬度和肌層厚度是反映腸道組織結構的3 個重要指標，其中絨毛長度和絨毛寬度可反映腸道組織消化吸收的表面積大小，而肌層厚度可反映腸道的收縮能力，可間接反映機體腸道組織的消化吸收能力。本試驗腸道組織切片結果顯示，投喂頻率、水溫、養殖密度及三因素交互作用對腸道絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度均無顯著影響。謝蘇明［18］研究發現，投喂頻率對大口黑鱸腸道絨毛高度和絨毛寬度無顯著影響，但2 次/d 投喂頻率處理的大口黑鱸腸道肌層厚度顯著厚于4 次/d 的投喂處理。本試驗處理Ⅰ、Ⅴ大口黑鱸的腸道絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度整體大于其他處理，與個別處理差異達顯著水平，這一結果與本試驗大口黑鱸的生長性能特定生長率和攝食率結果呈正相關。

3.3 投喂頻率、水溫和養殖密度對大口黑鱸肝臟GH 和IGF-I 基因表達量的影響

魚類的營養代謝和生長發育受到GH、IGF-1相關基因調控。魚類的GH 主要由魚腦垂體前葉嗜酸性細胞分泌，研究發現GH 在羅非魚肝臟中也有表達，但在肝臟中的表達量遠低于腦垂體［26］。GH 作為魚類生長發育過程中的調控因子，發揮了促進生長、調控攝食、促進蛋白質和脂肪代謝、調節魚類滲透壓和提高飼料轉化率的生理作用。魚類IGF-1 主要由GH 與靶細胞膜表面的GHR結合后，開啟細胞內的信號傳導機制，促成魚類肝臟組織細胞合成和分泌一類多肽類激素［11,27］，IGF-1 在魚類生長發育過程中發揮的主要作用是作為GH的介導激素，介導GH 促進動物機體生長的因子［28］。本研究單因素方差分析結果顯示，各試驗處理肝臟GH和IGF-1基因表達量均有顯著差異，但無明顯的規律趨勢；肝臟GH和IGF-1基因表達量各處理比較，處理Ⅰ（2 次/d，25 ℃，25 尾/缸）和處理Ⅴ（3 次/d，25 ℃，25 尾/缸）整體高于其他處理，表明大口黑鱸幼魚在投喂頻率為2～3 次/d、水溫為25 ℃、養殖密度為25 尾/缸的養殖條件下，肝臟GH和IGF-1基因表達量高于其他條件。這一結果與本試驗特定生長率結果一致，表明肝臟GH和IGF-1基因表達量可作為評估指標來反映魚類的生長情況，這與謝蘇明等［10］報道的觀點相一致。以往關于投喂頻率、水溫和養殖密度三因素交互對魚類影響的研究未見報道，本試驗主效應分析結果表明，投喂頻率、水溫、養殖密度及三者交互效應對肝臟GH和IGF-1基因表達量均無顯著影響。但肝臟GH和IGF-1基因表達量與投喂頻率、水溫和養殖密度均呈負相關關系，這一結果與前人研究結果基本一致。謝蘇明等［10］研究發現以2 次/d頻率投喂的大口黑鱸幼魚肝臟GH（P＞0.05）和IGF-1（P＜0.05）的基因表達量高于以3 次/d 頻率投喂的處理。王曉梅等［29］研究發現，胡子鯰低密度處理GH基因表達量高于高密度處理。

4 結論

本試驗條件下，主效應投喂頻率僅對形體指標肥滿度有顯著影響，養殖密度僅對采食率有顯著影響，水溫對生長性能、腸道組織結構、肝臟GH和IGF-1基因表達量各指標均無顯著影響，3 因素交互效應僅對肥滿度有顯著影響，對其他各指標均無顯著影響。經單因素方差分析和Duncan 氏多重比較，大口黑鱸生長性能、腸道組織結構及肝臟GH和IGF-1基因表達量結果表明，本試驗條件下大口黑鱸最適宜的投喂頻率為2～3 次/d，水溫為25 ℃，150 L 水體養殖25 尾。