胡椒堿對急性心肌梗死大鼠HMGB1、IL-1β和IL-6水平的影響*

石亞其 雷玉華 王 勇 張 倩

（湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫院，湖北 恩施 445000）

我國血管疾病的發生率和病死率不斷上升，給社會帶來了沉重的醫療負擔［1］。急性心肌梗死（AMI）在心血管疾病中最為嚴重，尋找安全有效的AMI防治策略具有重要的臨床意義［2］。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是新近發現的炎癥介質，由215個氨基酸構成，包含2個同源性DNA結合區（A盒和B盒）以及一個負性C末端［3］。HMGB1幾乎存在于所有細胞的細胞核和細胞質中，是一種高度進化保守的非組蛋白DNA結合蛋白。HMGB1作為DNA伴侶能穩定核小體，參與DNA的復制和修復，調控基因轉錄和調節甾體類激素受體的活性等［4］。心肌缺血時，HMGB1可由壞死和損傷的心肌細胞被動釋放，或由活化的單核/巨噬細胞主動分泌，升高的HMGB1通過激活下游信號通路直接誘導合成分泌白細胞介素-1β（IL-1β）和白細胞介素-6（IL-6）等炎癥因子，進一步損傷心肌組織［5］。胡椒堿是黑胡椒與長胡椒中的一種酚類物質，能夠發揮抗氧化、抗炎、免疫調節等多重藥理功效［6］。近年來，有研究發現胡椒堿可通過減輕炎癥反應而改善缺血性心肌病損傷，但目前針對胡椒堿防治AMI的研究甚少［7］。因此，本研究擬觀察胡椒堿對AMI大鼠的心臟保護作用并探究其對HMGB1、IL-1β和IL-6水平的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只SPF級雄性SD大鼠（年齡8周），購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物合格證號：11400700041438，動物許可證號：SCXK（京）2016-0011。飼養環境光線明暗交替，濕度（40±10）%，溫度（25±2）℃。本實驗經過恩施土家族苗族自治州中心醫院倫理審查委員會的批準（批準號：20200012A）。

1.2 試藥與儀器

胡椒堿（純度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司，貨號：A0200）。IL-1β ELISA試劑盒（Elabscience公司，貨號：E-EL-R0012c）；IL-6 ELISA試劑盒（Sigma公司，貨號：RAB0311）；HMGB1 ELISA 試劑盒（Elabscience公司，貨號：E-EL-R0505c）；TTC試劑（Sigma公司，貨號：17779）。電子天平（上海良品儀器廠）；低溫高速離心機（日本Hitachi公司）；石蠟包埋機及切片機（德國Leica公司）；光學顯微鏡（日本Olympus公司）；多功能圖像分析系統（德國Leica公司）；酶標儀（美國Bio-Rad公司）；小動物呼吸機（上海奧爾科特公司）；獸用心電圖機（理邦精密儀器公司）；渦旋震蕩儀（無錫沃信儀器制造有限公司）。

1.3 分組與造模

將SD大鼠60只隨機分為5組，每組12只，即假手術組、模型組、胡椒堿低劑量組（10 mg/kg）、胡椒堿中劑量組（20 mg/kg）、胡椒堿高劑量組（30 mg/kg）。從胸骨左緣第3～4肋打開胸腔暴露心臟，用4-0絲線穿過大鼠左室前降支（LAD）起始部，通過拉緊絲線方式阻斷LAD，心電圖示ST-T抬高提示建模成功。假手術組只穿線不結扎，腹腔麻醉大鼠，行氣管插管，監測大鼠心電圖情況。

1.4 給藥方法

在AMI模型建立成功后即刻，胡椒堿低、中、高劑量組分別予胡椒堿10、20、30 mg/kg，假手術組、模型組給予10 mL/kg的生理鹽水，連續灌胃7 d。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 TTC染色檢測心肌梗死面積 末次給藥后2 h，用2%戊巴比妥鈉3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，充分暴露大鼠右頸靜脈，然后從右頸靜脈緩慢推入約1 mL TTC液。15 min后從右頸靜脈推入10%氯化鉀1 mL并取出心臟，-80℃條件下冰凍10 min。取出心臟，沿垂直心臟左室長軸縱向切成2 mm左右的薄片，并將心臟切片放入多聚甲醛中固定顯色，最終白色為梗死區域，根據白色區域面積占比大小評估梗死情況。

1.5.2 病理形態學分析大鼠心肌損傷 4%多聚甲醛固定心肌組織72 h后，將心肌組織經過脫水、透明、浸蠟、包埋等過程制成石蠟塊。制作的石蠟切片經蘇木精及伊紅染色后，用二甲苯和無水乙醇透明，透明的切片最后滴上中性樹脂封片，并在光學顯微鏡下觀察。

1.5.3 ELISA法測定HMGB1、IL-1β及IL-6水平 將心肌組織勻漿后，以2 000 r/min，4℃條件下離心20 min，留取上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測上清液中HMGB1、IL-1β及IL-6水平。

1.6 分子對接

使用Autodock Vina 1.1.2進行分子對接，以研究胡椒堿與HMGB1之間的結合情況。從RCSB蛋白質數據庫（http：//www.rcsb.org/）下載HMGB1的3D結構（PDB ID：4QR9）。從TCMSP數據庫下載（https：//old.tcmspe.com/tcmsp.php）胡椒堿（Molecule ID：MOL001592）的3D結構。運用AutoDockTools軟件將胡椒堿與HMGB1進行分子對接，通過Flexible Docking模塊分析分子間的結合位點及能量。設置參數時，“能量最大評價次數”設定為2 500 000，運行次數設定為10，其他參數為默認值。使用PyMoL進行可視化分析（http：//www.pymol.org/）。

1.7 統計學處理

應用SPSS22.0統計軟件。計量資料以（）表示。多組差異比較采用單因素方差分析，組間差異進行t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心肌組織病理改變

相較于假手術組，手術組心肌變性紊亂，細胞間質水腫，同時伴有炎性細胞浸潤。胡椒堿預處理能使心肌病理得到較好的改善，且這種改善呈劑量依賴性。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理改變（HE染色，100倍）

2.2 各組大鼠心肌梗死面積比較

見表1。TTC檢測心肌梗死面積發現，胡椒堿各劑量組心肌梗死面積小于模型組，有統計學差異（均P＜0.05），且梗死面積胡椒堿高劑量組＜中劑量組＜低劑量組。

表1 各組大鼠心肌梗死面積比較（%，±s）

表1 各組大鼠心肌梗死面積比較（%，±s）

注：與模型組比較，#P＜0.05；與胡椒堿低劑量組比較，*P＜0.05；與胡椒堿中劑量組比較，&P＜0.05。下同。

組別假手術組模型組胡椒堿低劑量組胡椒堿中劑量組胡椒堿高劑量組n5 5 5 5 5心肌梗死面積0 56.78±8.98 45.12±6.03#38.17±4.91#*30.36±3.92#*&

2.3 各組大鼠心肌HMGB1、IL-1β及IL-6水平比較

見表2。與假手術組相比，模型組HMGB1、IL-1β及IL-6表達水平升高（均P＜0.05）。胡椒堿預處理能呈劑量依賴性地降低HMGB1、IL-1β及IL-6表達水平（均P＜0.05）。

表2 各組大鼠HMGB1、IL-1β、IL-6表達水平比較（±s）

表2 各組大鼠HMGB1、IL-1β、IL-6表達水平比較（±s）

注：與假手術組比較，△P＜0.05。

組別假手術組模型組胡椒堿低劑量組胡椒堿中劑量組胡椒堿高劑量組n 5 5 5 5 5 HMGB1（μg/L）74.08±4.11 145.24±10.45△130.99±8.58#△114.82±7.05#△*100.33±6.12#△*&IL-1β（ng/L）0.66±0.18 2.65±0.69△1.83±0.55#△1.32±0.37#△*1.01±0.23#△*&IL-6（ng/L）0.45±0.06 1.43±0.31△1.05±0.18#△0.83±0.16#△*0.68±0.07#△*&

2.4 胡椒堿可靶向結合HMGB1

采用分子對接方法分析了胡椒堿與HMGB1的結合能力，兩者之間的結合能預測為-8.01 kcal/mol，這提示胡椒堿可靶向結合HMGB1。見圖2。

圖2 胡椒堿可靶向結合HMGB1

3 討論

本研究結果表明，AMI后心肌HMGB1、IL-1β及IL-6水平顯著增高，而胡椒堿呈劑量依賴性地縮減心肌梗死面積，改善心肌細胞變性壞死，降低HMGB1、IL-1β及IL-6水平。同時分子對接分析表明胡椒堿與HMGB1有較強的靶向結合能力。這些結果表明，胡椒堿能對AMI后的心肌發揮保護作用，其作用可能是通過靶向結合HMGB1，降低HMGB1、IL-1β及IL-6的表達來實現的。

大量實驗研究已證實，IL-1β、IL-6等炎性因子在心肌IRI的發生發展過程中起到重要作用［8］。HMGB1被證實為一種含量豐富的非組蛋白核蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移率快的特性而得名，HMGB1在細胞內可促進基因轉錄，穩定核小體、促進DNA重組、復制和折疊，調控轉錄過程［9］。當HMGB1釋放到細胞外成為機體的一種“危險信號”時，即可在許多嚴重炎癥性疾病中扮演至關重要的角色，比如敗血癥、急性肺損傷、風濕性關節炎等［10-12］。近年來研究發現，HMGB1在心肌梗死及心肌缺血再灌注損傷等心血管疾病的發生和發展過程中同樣起著重要的作用［13-14］。最近，我們的研究發現穩定型心絞痛和不穩定型心絞痛患者血清HMGB1表達明顯增高，并且與冠狀動脈狹窄程度成正相關。Dong等［15］證實缺血再灌注大鼠心肌HMGB1的表達與IL-1β和IL-6的表達成顯著正相關，進一步表明HMGB1可促進多種炎癥因子的表達和釋放。此外，有研究證實IL-6能夠刺激巨噬細胞釋放HMGB1并呈時間和劑量依賴性，表明兩者可以形成正反饋，共同促進炎癥發展［16］。以上研究結果提示HMGB1與其他促炎因子之間存在著一種相互促進釋放的正反饋效應，可在多種疾病的發生和發展過程中起著關鍵作用。

相關理論認為，AMI等缺血性心肌病存在血瘀病證。多項藥理研究表明，胡椒堿具有通瘀血，改善缺血性損傷及抗炎等藥理活性［17］。Guo等發現胡椒堿可通過減輕炎癥反應而對大鼠冠脈結扎后引起的心肌缺血損傷發揮保護作用［18］。宋思維等報道胡椒堿可有效降低過氧化氫所致心肌細胞炎癥反應［19］。本研究結果表明，胡椒堿可以降低AMI后心肌中HMGB1、IL-1β及IL-6的高表達，從而減小心肌梗死面積，發揮心肌保護作用。

分子對接作為一種研究藥物分子和受體之間相互作用的方法，可從理論上模擬并預測藥物分子與受體的結合模式和親合力，已成為計算機輔助藥物研究領域的一項重要技術［20］。一般來說，分子與靶點結合能越低表示分子間結合得越穩固，交互作用可能性越高，結合能＜0 kcal/mol時分子與靶點具有結合能力，結合能≤-5.0 kcal/mol時結合得較好，結合能≤-7.5 kcal/mol結合得非常好［20］。本研究發現，胡椒堿與HMGB1兩者之間的結合能為-8.01 kcal/mol，這提示胡椒堿可很好地靶向結合HMGB1從而影響其介導的促炎因子釋放。胡椒堿對HMGB1的直接靶向作用進一步解釋了胡椒堿降低AMI心肌中HMGB1及相關炎癥因子表達的原因。總之，本研究初步探討了胡椒堿對AMI心肌的保護作用及可能的機制，為AMI的藥物治療提供了新思路。