長蛇灸激活PPARγ改善初發強直性脊柱炎大鼠的機制研究*

余希婧 黃 輝 胡秀武 朱俐娜 耿樂樂 呂明芳 華水生

（1.江西省南昌市洪都中醫院，江西 南昌 330038；2.江西省南昌市長蛇灸效應機制和督脈特異性重點實驗室，江西省針灸醫學臨床研究中心，江西 南昌 330038）

強直性脊柱炎（AS）是一種免疫介導的炎癥性疾病，是常見的進行性風濕性疾病，伴有疼痛及結構和功能損害［1-2］。AS是脊柱關節病患者中最常見的影響中軸骨骼的疾病，可導致炎性腰痛，嚴重影響患者的生活質量［3］。炎癥反應是AS的重要因素，AS引起的脊柱炎癥可逐漸導致胸椎和肋椎關節的融合和骨化，在AS的早期若未進行有效干預，部分患者的背部后凸度增加，胸部僵硬，胸腔內永久性不動，并出現聯合體，使得脊柱活動度降低［4-6］。

近年來，許多研究表明中醫藥對AS有顯著療效，如針刺、針灸結合、溫針、電針、蜂療、火針療法等都可顯著改善AS癥狀［7-9］。已有研究明確了AS中炎性細胞因子是改善AS危險分層和評價治療方法的重要指標［10］，另一方面，激活過氧化物酶體增殖激活受體（PPARγ）可顯著抑制炎癥因子的表達［11］。雖然目前尚不清楚AS的發病機制，但白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子在AS發病中起著重要作用［12-14］。在臨床上采用長蛇灸治療可顯著改善AS早期患者的臨床癥狀和體征，但長蛇灸改善AS的分子機制尚需進一步研究。本研究主要觀察長蛇灸是否通過激活PPARγ來抑制炎癥因子從而改善早期AS大鼠模型，有望阻斷或延緩疾病的快速進展。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3月齡健康SD大鼠，共48只，雌雄不限，體質量250～280 g，購自北京華富康生物科技有限公司。本實驗中的動物模型按照我院動物倫理委員會的指導原則進行處理（倫理號：S2020ZPYFB0996）。

1.2 試藥與儀器

艾絨購于南陽神農艾草生物制品有限公司。二甲基十八胺購于美國Sigma。ELISA試劑盒（美國R&D systems公司），Bio-Rad微孔板熒光分光光度計（美國Rayto），Trizol試劑（美國Invitrogen），RNA反轉錄試劑盒（美國賽默飛），qPCR試劑盒（百邁客生物），RIPA裂解液（北京鼎國長生生物），BCA試劑盒（北京鼎國長生生物），PVDF（美國Bio-Rad），ECL顯色液（美國賽默飛）。

1.3 模型制備

把大鼠隨機分為4個組，空白對照組、模型組、長蛇灸組、假長蛇灸組，每組12只。用二甲基十八胺溶解人蛋白多糖提取物，腹腔注射2 mg，每周2次，共4次，構建強直性脊柱炎模型［15］?？瞻讓φ战M注射同劑量的生理鹽水。2周后評估大鼠的關節炎癥狀和體征［16］，評分標準為0分（無癥狀）、1分（1個腳趾紅腫）、2分（多個腳趾紅腫）、3分（腳趾僵硬）和4分（畸形或腳踝受累）。

1.4 治療方法

成模后開始進行長蛇灸治療，大鼠沿背側頸部脊柱督脈減去寬約0.5 cm毛發，將大鼠背側向上固定于工作臺上，取生姜研磨成糊狀，在背側沿頸部脊柱督脈擺放成寬0.4 cm、高0.3 cm的長方條，用純艾絨搓成細條狀，鋪在姜層上點燃，燃盡為1壯，每次5壯，隔日1次，共7次。假長蛇灸組操作同治療組，不點燃艾絨。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 細胞因子的ELISA分析 麻醉大鼠取眼眶后血液氮保存。用ELISA試劑盒測定血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IL-23的含量。用Bio-Rad微孔板熒光分光光度計在405 nm處測量光密度，然后分析數據。

1.5.2 實時定量PCR分析細胞因子mRNA 最后1次長蛇灸治療4 h后，麻醉取大鼠椎體組織，使用Trizol試劑從組織中分離RNA。將提取的RNA逆轉錄為cDNA，按照試劑說明書進行qPCR實驗。引物如下：IL-1β 正義鏈：5'-TGAGACCTAGTGTGG-3'，反義鏈：5'-TCCATTGAGGGAGGCTT-3'；IL-6正義鏈：5'-AGCTAACGCGACTTC-3'，反義鏈：5'-TGACGTCGAACGCA GTGC-3'；TNF-α 正義鏈：5'-CGAGTAGCGTGCGTA-3'，反義鏈：5'-GTTACTGTCGAGATGTCAT-3'；IL-17正義鏈：5'-ATGCTTGATCATGACTGT-3'，反義鏈：5'-CTATACATCATGGTCATG-3'；IL-23正義鏈：5'-CTAAGTCCTGCGACTGA-3'，反義鏈：5'-CGATCCTAGCAATGAC-3'；β-actin正義鏈：5'-TGTCAACTGGGACGATA-3'，反義鏈：5'-GGGGTGTTGAAGGTCAAA-3'。

1.5.3 Western blotting 麻醉大鼠取20 mg的AS組織，用100 mL RIPA裂解液在冰上30 min充分裂解組織。4℃、12 000 r/min離心15 min，用BCA試劑盒檢測蛋白質濃度。用12%SDS聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質（50 μg），轉移到PVDF上。5%脫脂牛奶封閉，然后將PVDF膜在4℃孵育一抗過夜，再用二抗在室溫下孵育1 h，并用ECL顯色液顯色。用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度。

1.6 統計學處理

應用SPSS22.0統計軟件。計量資料以（）表示，采用雙因素方差分析對不同組間的外周疾病進展情況進行分析，單因素方差分析用于比較蛋白質表達水平。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠不同時間關節平均評分比較

見圖1，表1。通過監測足爪腫脹和后腿關節僵硬來評估AS周圍性關節炎，模型組與空白對照組相比評分顯著增高，長蛇灸組與模型組相比評分顯著下降，表明長蛇灸可顯著改善AS模型大鼠的周圍關節炎。

表1 各組大鼠不同時間關節平均評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠不同時間關節平均評分比較（分，±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與長蛇灸組比較，#P＜0.05。下同。

組別空白對照組模型組長蛇灸組假長蛇灸組n 12 12 12 12 0 d 0.17±0.29 0.29±0.27 0.33±0.26 0.30±0.27 1 d 0.33±0.29 0.43±0.35 0.29±0.39 0.36±0.48 3 d 0.21±0.27 0.86±0.90 1.00±0.82 1.14±0.69 5 d 0.25±0.27 1.86±0.90*2.14±0.69 2.00±0.82 7 d 0.21±0.26 3.14±1.07*3.29±1.38△3.57±1.27 9 d 0.14±0.24 4.29±1.11*3.43±1.27△4.43±0.79#11 d 0.16±0.21 5.86±1.07*4.00±0.82△5.93±1.10#13 d 0.08±0.20 6.79±1.22*4.57±1.13△6.64±1.11#15 d 0.07±0.19 8.50±1.04*5.14±0.90△8.21±1.41#

圖1 長蛇灸對周圍病進展及關節平均評分的影響

2.2 各組大鼠炎性細胞因子水平比較

見表2。與空白對照組相比，模型組的TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-23和IL-6水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，長蛇灸組的TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-23和IL-6水平顯著降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠外周血炎性細胞因子水平比較（pg/mg，±s）

表2 各組大鼠外周血炎性細胞因子水平比較（pg/mg，±s）

組別空白對照組模型組長蛇灸組假長蛇灸組n 12 12 12 12 IL-1β 1.63±0.32 8.13±1.64*4.60±0.36△9.60±1.28#TNF-α 15.13±3.01 45.63±2.12*27.47±2.50△42.57±2.21#IL-6 1.57±0.31 8.57±1.66*4.60±0.85△9.60±1.55#IL-17 11.17±1.04 18.83±1.40*13.67±1.36△20.13±2.65#IL-23 95.27±4.61 182.07±10.72*120.70±10.01△183.70±15.19#

2.3 各組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IL-23的mRNA表達水平比較

見表3。與空白對照組比較，模型組TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，長蛇灸組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IL-23的mRNA水平顯著降低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IL-23 mRNA表達水平比較（%，±s）

表3 各組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IL-23 mRNA表達水平比較（%，±s）

組別空白對照組模型組長蛇灸組假長蛇灸組n 12 12 12 12 IL-1β mRNA 92.07±10.55 205.33±17.89*148.90±16.16△209.87±27.57#TNF-α mRNA 93.07±14.05 305.53±20.52*176.30±7.65△314.17±22.42#IL-6 mRNA 97.57±2.31 185.10±13.26*141.70±5.96△186.13±23.48#IL-17 mRNA 96.30±3.44 275.77±23.15*205.33±14.71△292.47±26.53#IL-23 mRNA 99.23±0.80 246.93±14.84*165.70±14.93△243.77±30.66#

2.4 各組大鼠PPARγ表達比較

見圖2，表4。與正常大鼠相比，模型大鼠PPARγ表達顯著下降（P＜0.05）。與模型組相比，長蛇灸組的PAARγ表達水平顯著增加（P＜0.05）。

表4 各組大鼠PPARγ/β-actin表達比較（±s）

表4 各組大鼠PPARγ/β-actin表達比較（±s）

組別空白對照組模型組長蛇灸組n 12 12 12 PPARγ/β-actin 0.18±0.06 0.06±0.01*0.30±0.14△

圖2 各組大鼠PPARγ條帶

3 討論

AS是一種病因不明的全身性自身免疫性疾病，早期的癥狀是脊柱和骶髂關節的骨關節侵蝕，最終導致強直和纖維化，炎癥因子在自身免疫炎癥反應中發揮重要作用［17-18］。促炎細胞因子的濃度升高導致AS患者局限于脊椎和骶骨關節的軸向表現，強直是由于間充質細胞的增殖和生長以及富含蛋白多糖的膠原基質的聚集，在關節中炎癥介質緩慢地損害骨組織。研究證實，炎癥介質如IL-6、IL-1β和TNF-α刺激破骨細胞和其他炎癥細胞加重病變［19-20］。在細胞中PPARγ對炎癥因子轉錄起著關鍵作用，其激活后可減輕炎癥損傷［21］。有研究報道，艾灸治療通過抗炎發揮緩解強直性脊柱炎的結構和功能，改善相關癥狀［22-23］。長蛇灸是否通過激活PPARγ并最終減少炎癥因子的釋放來緩解AS目前尚不清楚。

本研究結果表明，在AS大鼠模型早期長蛇灸治療能減輕疾病進展程度，同時長蛇灸對IL-6、IL-1 β、IL-17、IL-23和TNF-α等促炎細胞因子具有顯著抑制作用，也顯著下調IL-6、IL-17、IL-23、IL-1β和TNF-α的mRNA表達水平。PPARγ激活可抑制炎癥因子表達［24-26］。本研究進一步發現長蛇灸可在AS模型中激活PPARγ的表達。因此，筆者認為長蛇灸可能通過激活PPARγ抑制IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-17和IL-23等炎癥因子的表達從而緩解AS。

AS的主要病因尚不清楚，然而已經明確的是促炎細胞因子如TNF-α的釋放、IL-1β、IL-6參與了AS的發病機制［11，27］。TNF-α是病程中的一種多功能細胞因子，已有研究表明AS患者骶髂關節內TNF-α水平較高［28］。TNF-α抑制劑可以減輕AS患者的臨床癥狀和體征，并與血清C反應蛋白（CRP）水平和軸性炎癥同步變化［29］。此外，AS患者血清IL-6水平升高。先前的研究報道，IL-6與AS患者的疾病活動呈正相關［11］。AS患者IL-6水平升高與CRP、血小板計數及臨床參數呈正相關［30］。此外，IL-1β由有核細胞分泌，但主要由巨噬細胞分泌，并參與炎癥，在AS初期，人體IL-1β表達水平明顯升高。本研究發現，長蛇灸可激活PPARγ，同時抑制外周血中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17和IL-23的表達。

綜上所述，在AS大鼠模型初期介入長蛇灸治療可能通過激活PPARγ發揮抗炎作用，延緩AS病情的快速進展，縮短病程。AS模型中，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IL-23顯著增加，同時PPARγ顯著下調，通過長蛇灸治療可顯著激活PPARγ，同時抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IL-23的表達。因此，長蛇灸通過緩解炎癥來改善初發AS是有價值的治療策略，本研究為長蛇灸治療AS提供了理論依據。