益木腦液灌腸對肝性腦病大鼠腦蛋白表達的影響*

周 爍 周振國 劉昕艷 李京濤 柏魯寧△

（1.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫藥大學附屬醫院，陜西 咸陽 712046）

肝性腦病（HE）是指由急性或慢性肝功能衰竭引起的中樞神經系統疾病。HE的癥狀包括個性改變、注意力缺陷、睡眠節律改變、認知障礙，嚴重時可致昏迷［1］。HE系多因素共同作用的結果，其發病機制尚未明確，目前暫無特效措施，因此，臨床急需探索治療HE臨床見效的新藥物。已有臨床觀察［2］表明，由國家級名中醫常占杰教授研制的益木腦液可有效改善HE，與西醫保守治療聯合應用取得了良好的效果。基于前期課題組研究［3］，本實驗采用50% 四氯化碳（CCl4）聯合硫代乙酰胺（TAA）建立大鼠肝硬化HE模型，探討益木腦液對HE腦蛋白的治療作用及機制，為進一步探討HE的臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性成年SD大鼠72只，質量220～250 g，購于成都達碩實驗動物有限公司，合格證號：2020（川）-030，溫度20～25℃，濕度60%，晝夜光照時間各12 h，自由飲食飲水。所有實驗大鼠操作程序均經陜西中醫藥大學醫學倫理委員會批準實施。

1.2 實驗藥物 益木腦液：生大黃30 g，蒲公英30 g，石菖蒲30 g，烏梅30 g，煅牡蠣20 g，芒硝20 g。中藥均由陜西中醫藥大學附屬醫院藥劑科統一購買，符合《中華人民共和國藥典》（一部）要求，全方藥物分別按照比例稱重、混合，煎煮、濾過后，經60℃旋轉蒸發濃縮，凍干，每克含生藥8 g，凍干粉密封保存于4℃冰箱內備用，使用時100℃水溶解。乳果糖（北京韓美藥業有限公司，2005005）

1.3 試劑與儀器 TAA（中國醫藥集團上海化學試劑有限公司，YH21010802）；CCl4（阿拉丁，批號：C128126）；血氨試劑盒（A086-1-1）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）試劑盒（C009-2-1）、血清天冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑盒（南京建成生物工程研究所，C010-2-1）；5-羥色胺（5-HT）試劑盒、去甲腎上腺素（NE）試劑盒（上海聯邁生物工程）；GABA抗體、GFAP抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。包埋機（武漢俊杰電子有限公司，型號：JB-P5）；石蠟切片機（上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016）；酶標儀（雷杜生命科技有限公司，型號：RT-6100）；顯微鏡（Nikon公司，型號：E100）。

1.4 分組及造模 適應性飼養7 d后，在72只SD大鼠中隨機選取10只大鼠作為空白對照組，剩余62只大鼠為模型組。參考文獻［4］制備肝性昏迷大鼠模型。模型組大鼠按5 mL/kg給予50%CCl4溶劑（50 mL橄欖油+50 mL CCl4）腹腔注射，每周2次，根據體質量變化調整劑量，共12周。第13周按300 mg/kg給予3%TAA溶液隔日腹腔注射，隔天1次，連續2次，對照組大鼠給予等量橄欖油腹腔注射。若大鼠出現嗜睡、反應遲緩，自主活動減少、共濟失調、昏迷等癥狀之一，即可判斷造模成功。造模過程中，模型組大鼠死亡17只，對照組未出現死亡。

1.5 給藥方法 將第13周造模成功的45只SD大鼠隨機分為模型組、乳果糖組和益木腦液低、中、高劑量組，每組9只。乳果糖組以5.63 mL/kg的劑量給予乳果糖灌腸，益木腦液低、中、高劑量組分別以0.56、1.12、2.24 g/kg的劑量給予益木腦液灌腸，對照組及模型組給予等量蒸餾水灌腸，給藥體積均按5 mL/kg計，每日1次，連續給藥14 d。藥物干預過程中，模型組大鼠死亡3只，乳果糖組死亡1只，益木腦液低、中、高劑量組各死亡2、1、1只。

1.6 標本采集與檢測 1）血氨、血清生化指標檢測。大鼠末次給藥結束后，禁食不禁水12 h，次日采用20%烏拉坦（1 g/kg）對大鼠進行麻醉，腹主動脈取血，一部分血液予以肝素鈉抗凝，并在0.5 h內檢測血氨水平；剩余血液于4℃靜置3 h后，以3 000 r/min轉速離心，取上清，凍存管分裝，-80℃冰箱保存。采用ELISA試劑盒，按試劑盒說明書分別檢測ALT、AST、5-HT及NE。2）免疫組織化學。脫頸處死大鼠，冰上取大鼠腦組織，4%多聚甲醛固定。采用免疫組織化學法，通過脫蠟，滅活內源性過氧化物酶，抗原修復，封閉孵育，一抗、二抗、SABC孵育，顯色復染，封片，觀察GFAP、GABA的表達。

1.7 統計學處理 采用SPSS 21.0統計學軟件進行分析，經檢驗所有數據均符合正態分布，計量數據以（）表示，各組間方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清ALT、AST、血氨水平比較 見表1。與空白對照組相比，模型組大鼠ALT、AST及血氨水平顯著升高，且差異具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，乳果糖組及益木腦液低、中、高劑量組都能顯著降低大鼠血清中ALT、AST及血氨水平，且差異具有統計學意義（P＜0.05）。與乳果糖組相比，益木腦液高劑量組中ALT、AST及血氨水平下降明顯，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清ALT、AST、血氨水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清ALT、AST、血氨水平比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與乳果糖組比較，△P＜0.05。下同。

組別空白對照組模型組乳果糖組益木腦液低劑量組益木腦液中劑量組益木腦液高劑量組n 10 6 8 7 8 8 ALT（U/L）40.4±3.3 120.2±15.2*77.6±12.4*#83.0±10.4*#78.3±8.4*#65.4±14.7*#△AST（U/L）103.2±15.2 233.4±24.5*167.1±19.7*#176.9±20.6*#165.5±14.4*#147.9±22.7*#△血氨（μmol/L）72.5±7.0 166.1±10.0*145.5±9.6*147.3±10.7*#142.9±8.1*#124.9±15.6*#

2.2 各組大鼠神經遞質表達水平比較 見表2。與空白對照組比較，模型組大鼠5-HT、NE水平顯著升高，且差異具有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，乳果糖組及益木腦液中、高劑量組血漿中5-HT、NE水平降低，且差異具有統計學意義（P＜0.01）；與乳果糖組比較，益木腦液高劑量組血漿中5-HT及NE水平顯著降低，且差異具有統計學意義（P＜0.01）。

表2 各組大鼠血漿中神經遞質表達水平比較（μg/mL，±s）

表2 各組大鼠血漿中神經遞質表達水平比較（μg/mL，±s）

組別空白對照組模型組乳果糖組益木腦液低劑量組益木腦液中劑量組益木腦液高劑量組n 10 6 8 7 8 8 5-HT 10.9±1.8 16.9±5.6**12.1±11.6#14.3±8.4 10.6±5.1##7.2±4.7##△NE 1.4±0.5 5.4±1.9**4.6±1.7 5.3±1.8 4.1±1.9 2.8±1.3##△

2.3 各組大鼠腦組織GFAP、GABA蛋白表達比較 在空白對照組中，腦皮層中由GFAP著色所示的星形膠質細胞分布均勻，形態正常；與空白對照組相比，模型組中GFAP著色所示的星形膠質細胞顏色加深，細胞形態出現顯著腫脹，說明肝性腦病后大鼠腦皮層組織中的星形膠質細胞出現明顯的增殖；與模型組相比，益木腦液給藥組GFAP著色數量減少，細胞腫脹程度降低，具有明顯改善細胞腫脹和增殖的作用。見圖1。

圖1 各組大鼠腦皮層GFAP星形膠質細胞表達（200倍）

在空白對照組中，海馬內GABA著色所示神經細胞結構完整，分布均勻，排列整齊；與對照組相比，模型組陽性表達增多，海馬內神經細胞核固縮變形，染色加深，細胞排列紊亂；與模型組相比，益木腦液組的GABA著色數量下降，具有明顯改善神經細胞的作用。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬區GABA神經細胞表達（200倍）

3 討論

HE又稱肝昏迷，是肝病晚期常見的并發癥和死亡原因，發生在肝硬化患者中的概率達30%～80%，嚴重影響患者的生活質量［5-6］，其發病機制較為復雜，尚未完全闡明。現如今，氨中毒學說、神經遞質改變等研究已較為成熟，外周炎癥反應、腦血流量改變、半通道功能障礙等學說也日益受到重視［7］。

HE發生的確切機制尚不完全清楚，但氨作為一種神經毒素是參與HE發病機制的關鍵。正常情況下，氨主要由肝臟代謝，但在肝功能障礙時，血氨濃度上升，氨隨之彌散入腦，與星形膠質細胞胞質內的谷氨酰胺合成酶發生反應，生成谷氨酰胺，谷氨酰胺進入線粒體后又在谷氨酰胺脫氫酶的作用下分解為氨［8］，氨繼而促進活性氧-氮簇釋放，觸發氧化/氮化應激反應，導致線粒體通透性改變，引發星形膠質細胞水腫，GFAP作為膠質細胞的骨架蛋白，是星形膠質細胞特有的胞漿內絲蛋白，能夠起維持星形膠質細胞結構和功能的作用，作為星形膠質細胞的特異性標志物［9］，在星形膠質細胞腫脹時可引發其表達上調。同時高氨可誘導星形膠質細胞的蛋白發生酪氨酸硝化反應［10］，使GFAP表達上調，破壞星形膠質細胞的結構和功能，引起星形膠質細胞的水腫，并進一步引發腦水腫，加重HE。研究表明，高氨血在導致星形膠質細胞水腫的同時，亦導致星形膠質細胞膜上多種神經遞質的代謝紊亂，如GABA、Glu、5-HT、NE等［11］，引起興奮性與抑制性神經遞質失衡，干擾正常腦活動。5-HT與NE均為真性神經遞質，廣泛分布于神經系統，5-HT具有平衡中樞神經穩態、調節思維活動等［12］廣泛生物學作用，研究表明NE對心理、行為及情緒都有調節作用［13-14］，實驗證明［14］，在高血氨影響下，大鼠腦神經核內5-HT轉運異常，使5-HT在細胞外液中累積并致使其異常增高，同時由于高血氨的刺激，大鼠腦皮質前NE轉運點位消耗增加，轉運減少，導致細胞外液的NE濃度上升，引發腦水腫，并進一步加劇HE。GABA為中樞神經主要的抑制性神經傳達物質，主要由腸道菌群產生，正常情況下吸收后由肝臟進行代謝，肝衰竭時則可以直接進入體循環，GABA與其他神經遞質交互作用，影響運動、體溫調節、肌緊張、睡眠、應激等行為［15］，HE時，肝功能異常，血GABA水平升高，GABA入腦增多，中樞神經系統抑制作用增強，進而影響神經傳遞、運動協調和學習能力［16］。本實驗結果表明，益木腦液與乳果糖治療組均可以改善血氨濃度，使GFAP蛋白表達下調，NE濃度降低。與乳果糖組相比，益木腦液高劑量組的GFAP顯著下調，NE濃度明顯降低，說明益木腦液有較好的降低血氨、減少肝細胞損害，改善肝臟的功能。益木腦液和乳果糖組的GABA、5-HT表達水平較模型組均有所減少，以益木腦液治療組改善更為突出，且益木腦液高劑量組與乳果糖治療組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）。說明益木腦液能夠醒腦開竅，有效緩解星形膠質細胞腫脹，調節神經遞質水平，改善HE癥狀。

中醫學認為，HE屬本虛標實之證，是由肝疏泄失常，脾運化功能減弱，氣血瘀阻凝滯導致的大腸傳導失司、腑氣不通，使瘀毒、痰濁、濕熱積結于內，濁氣上逆，犯于腦竅，進而神機失靈。益木腦液善攻邪泄毒，輕清通竅。方中生大黃活血通經，與芒硝相合可攻邪瀉毒以開竅；蒲公英清熱解毒；石菖蒲寧神益智，有腦保護的作用，其性溫，可以起到防諸藥過于苦寒而傷正的作用；烏梅性平，歸肝、脾、大腸經，與煅牡蠣同用可收澀固澀，防止泄下過多而傷正。6藥并用，溫中收斂，苦寒攻下，使濁有所出；臟腑氣機宣通，則神明安寧。以上6藥合用具有抑菌消炎、減少內毒素，改善肝功能及神經功能的作用［2，17］。本實驗也表明，益木腦液在降低血氨水平、調節神經遞質等方面具有較為顯著的效果，是具有顯著治病優勢和良好推廣前景的有效臨床方案。

由于HE系多種致病因素共同作用所致，因此HE臨床上具有復雜性、多樣性的特點［18］，所以在治療過程中，應采取多環節、全方面的綜合治療方案［19］。目前治療HE的臨床手段主要為剔除誘因、脫氨、人工肝及肝移植，但各有其局限性［20］，而中醫學對HE的治療有很大的優勢，由于中藥具有成分復雜的特點，可能存在治療上的多靶點，在臨床應用中也證實中藥灌腸［21］對于HE治療效果明顯，因此探究中醫藥對于HE的治療是發展趨勢之所在。