健脾清腸通絡方對三硝基苯磺酸鈉誘導重癥炎癥性腸病腸纖維化小鼠作用機制研究*

鄭 烈 聞新麗 段盛蕾

（陜西省中醫醫院，陜西 西安 710003）

重癥炎癥性腸病（IBD）是一種發生在胃腸道且原因不明、反復發作的慢性非特異性疾病，病變累及黏膜和黏膜下層，包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病2種亞型，是一種致死性腸道疾病，病情纏綿，病程日久，最終繼發腸纖維化。內科治療療效差，預后不良。腸纖維化被認為是重癥IBD不可避免的并發癥，可導致腸腔狹窄和梗阻，嚴重影響患者生活質量［1-2］。由于目前臨床缺乏有效的抗纖維化藥物，所以大多數患者需要手術治療。然而目前眾多學者對重癥IBD的研究主要以炎癥、黏膜損傷等研究為主，很少有學者從腸道最終病理結局腸纖維化入手解決臨床實際問題。因此，從腸纖維化入手解決臨床問題對改變患者病情進展和自然病程具有重要意義。研究腸纖維化的發病機制已成為臨床醫生的重要挑戰，亟須解決。中醫學認為，腸纖維化主要與濕熱瘀毒等因素有關，當腸道受到上述致病因素后會導致腸腑氣機不暢，脈絡閉塞，絡息成積，久病必有瘀，故導致腸纖維化［3］。故本研究以三硝基苯磺酸鈉（TNBS）灌腸誘導的小鼠結腸炎腸纖維化為模型，在前期研究的基礎上采用健脾清腸通絡方進行干預，該方由地榆散、香連丸、三棱丸方化裁而來，旨在探討該方對腸纖維化是否具有抑制作用，從而為臨床干預腸纖維化提供客觀依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級C57/BL6雄性小鼠40只，體質量（20±2）g，飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心，室溫（23±3）℃，12 h光照和黑暗循環，空氣濕度35%～45%。

1.2 藥物與試劑

1）健脾清腸通絡方混懸液。組方如下：黃芪30 g，黃連3 g，黨參15 g，生地榆15 g，馬齒莧30 g，白及3 g，木香6 g，三七6 g，三棱12 g，莪術12 g，生甘草6 g。將上述中藥濃煎至138 mL，使含生藥質量濃度為1 g/mL，低溫冰箱保存。2）美沙拉嗪混懸液。藥物購于佳木斯鹿伶制藥有限責任公司（國藥準字H19980148），采用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配置。3）TNBS購于Sigma公司（批號P2297），根據實驗需要采用50%的乙醇溶液配置。

1.3 分組與造模

適應性喂養1周后按照體質量編號，隨機分為4組：空白對照組（10只）、模型組（10只）、健脾清腸通絡方組（10只）和美沙拉嗪組（10只）。除正常組小鼠外，其余3組小鼠均建立TNBS誘導炎癥性腸病腸纖維化模型［3］。小鼠禁食24 h不禁水后采用7%水合氯醛（5 mL/kg）腹腔注射麻醉，模型組用直徑2 mm的醫用聚乙烯乳膠管經肛門輕輕插入腸道內約8 cm，第1日給予5%的TNBS 10 mg，第8日給予5%的TNBS 15 mg，第15日給予5%的TNBS 20 mg，第22日給予5%的TNBS 25 mg，第29日給予5%的TNBS 25 mg，根據實驗需要采用50%的乙醇溶液配置成0.8 mL的溶液全部灌入肛內，然后將小鼠尾部提起，倒置60 s，使藥液均勻到達全結腸。正常組采用同樣的方法注入等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.4 藥物干預

參照《中藥藥理研究方法學》［4］，從第22日開始，空白對照組和模型組給予等體積（0.3 mL/d）生理鹽水，健脾清腸通絡方組給予健脾清腸通絡方混懸液15 g/（kg·d）灌胃，美沙拉嗪組給予美沙拉嗪混懸液100 mg/（kg·d）灌胃，給藥2周。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 小鼠體質量變化 給藥結束時，稱取小鼠體質量，并詳細記錄。

1.5.2 小鼠疾病活動指數（DAI）［5］主要通過動物體質量、大便性狀及隱血情況進行評估。

1.5.3 小鼠結腸長度及質量 剪取小鼠全結腸后輕輕平展于濾紙上，測量結腸長度。濾紙上吸干水分后稱重。

1.5.4 各組小鼠結腸組織大體評分、病理評分變化比較 剪取小鼠全部結腸，從肛門直腸部開始至回盲部，剪取后小心清除結腸表面的脂肪組織，肉眼觀察各組小鼠結腸的大體形態，并參考文獻［6］評分。常規石蠟包埋，連續切片，HE染色，參考文獻［7］進行評分。

1.5.5 小鼠血清結締組織生長因子（CTGF）和Ⅲ型前膠原（PCⅢ）表達的檢測 分離各組小鼠血清后，低溫保存，然后按照ELISA試劑盒說明書（美國Cell Signaling Technology公司，產品貨號：3709S，11888S）操作檢測。具體方法：收集小鼠靜脈血清，12 000 r/min、5 min低溫離心，吸取上清液于1.5 mL EP管中，置于-80℃冰箱凍存，以供檢測。

1.5.6 小鼠結腸組織轉化生長因子-β（TGF-β）蛋白、CTGF、PCⅢ蛋白水平表達 采用Western blotting法檢測其表達情況，收集小鼠結腸組織，組織蛋白抽提，測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白質轉移、顯像、免疫檢測（封閉1 h，加入稀釋好的TGF-β抗體，4℃過夜，TBST洗膜3次，加入二抗，室溫孵育1 h，然后TBST洗膜3次），化學發光檢測蛋白表達情況。

1.6 統計學處理

應用SPSS23.0統計軟件。計量資料以（）表示，對所有符合正態性檢驗和方差齊性檢驗的數據，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠一般情況分析

見表1。經過4個周期干預后，模型組死亡小鼠4只，健脾清腸通絡方組和美沙拉嗪組均死亡2只。與空白對照組比較，模型組小鼠體質量明顯減輕（P＜0.05）、DAI評分明顯增加（P＜0.05），結腸長度明顯縮短（P＜0.05），結腸質量明顯增加（P＜0.05）；經健脾清腸通絡方和美沙拉嗪干預后，小鼠體質量、DAI評分、結腸長度和結腸質量均有不同程度的改善（P＜0.05），且美沙拉嗪組略優于健脾清腸通絡方組（P＞0.05）。

表1 各組小鼠體質量、DAI評分、結腸長度及質量比較（±s）

表1 各組小鼠體質量、DAI評分、結腸長度及質量比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別空白對照組模型組健脾清腸通絡方組美沙拉嗪組n 10 6 8 8體質量（g）23.45±0.21 16.53±0.32*20.95±0.24△21.87±0.19△DAI評分（分）0 6.12±0.78*1.87±0.46△1.26±0.38△結腸長度（cm）8.12±0.09 5.67±0.06*6.82±0.05△7.01±0.03△結腸質量（g）0.65±0.03 1.12±0.06*0.72±0.05△0.69±0.03△

2.2 各組小鼠結腸組織病理變化

見圖1。光學顯微鏡下，空白對照組腺體排列規則，間質內未見炎性細胞。模型組可見潰瘍形成，部分區域腺體缺失，間質水腫，嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等大量炎性細胞浸潤肌層，并可見纖維細胞增生，間質纖維化。健脾清腸通絡方組間質水腫減輕，肌層可見少量炎性細胞，纖維細胞增生和纖維化程度減輕。美沙拉嗪組間質水腫明顯減輕，肌層炎性細胞明顯減少，可見少量纖維細胞增生和纖維化改變。

圖1 各組小鼠結腸組織變化（HE染色，100倍）

2.3 各組小鼠結腸組織和病理組織評分比較

見表2。結果表明，模型組結腸組織大體評分、病理評分均增加（P＜0.05）；與模型組比較，健脾清腸通絡方組和美沙拉嗪組小鼠結腸組織大體評分、病理評分均減少（P＜0.05）。

表2 各組小鼠結腸組織大體評分、病理評分比較（分，±s）

表2 各組小鼠結腸組織大體評分、病理評分比較（分，±s）

組別空白對照組模型組健脾清腸通絡方組美沙拉嗪組n 10 6 8 8結腸大體評分2.12±0.53 6.25±0.71*4.35±0.54△4.21±0.52△結腸病理評分0 8.45±0.63*5.29±0.47△4.31±0.58△

2.4 各組小鼠血清CTGF和PCⅢ表達比較

見表3。與空白對照組相比，模型組CTGF和PCⅢ表達均增加（P＜0.05）；與模型組比較，健脾清腸通絡方組和美沙拉嗪組CTGF和PCⅢ表達均減少（P＜0.05）。

表3 各組小鼠血清CTGF和PCⅢ表達比較（pg/mL，±s）

表3 各組小鼠血清CTGF和PCⅢ表達比較（pg/mL，±s）

組別空白對照組模型組健脾清腸通絡方組美沙拉嗪組n 10 6 8 8 CTGF 186.93±22.46 892.04±35.29*306.27±26.78△285.93±22.45△PCⅢ272.56±8.75 365.28±10.42*302.85±7.32△297.36±5.24△

2.5 各組小鼠結腸組織TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白表達比較 見圖2，表4。與空白對照組比較，模型組結腸組織TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白表達增加（P＜0.05）；經健脾清腸通絡方和美沙拉嗪干預后小鼠結腸組織TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白表達減少（P＜0.05）。

圖2 小鼠結腸組織TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白表達條帶

表4 各組小鼠結腸組織TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白表達比較（±s）

表4 各組小鼠結腸組織TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白表達比較（±s）

注：與健脾清腸通絡方組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組模型組健脾清腸通絡方組美沙拉嗪組n 10 6 8 8 TGF-β1/β-actin 0.42±0.05 0.91±0.04*0.84±0.03△0.65±0.04#△CTGF/β-actin 0.43±0.05 0.92±0.06*0.75±0.04△0.56±0.12#△PCⅢ/β-actin 0.34±0.06 0.82±0.05*0.54±0.04△0.43±0.07#△

3 討論

近年來，隨著飲食結構的改變，IBD發病率逐漸呈上升趨勢，在我國患病人群沿海發達城市為主，由于久病難愈，嚴重影響患者日常生活和工作。腸纖維化是其并發癥之一。多研究表明，反復發作的腸道炎癥通過激活間充質細胞并產生細胞外基質（ECM）引發纖維化。在過去的十多年IBD患者腸纖維化并發癥并沒有得到有效改善，說明腸纖維化的發生發展是非常復雜的，包括炎癥和非炎癥過程。且目前影響IBD腸纖維化慢性炎癥的影響因素尚不清楚，因此，從抗纖維化治療聯合抗炎治療研究非炎癥作用機制是非常有必要的科研課題。然而，利用生物制劑等新藥物的抗炎治療在預防纖維化方面取得進展甚微。一旦ECM開始過度沉積，非炎癥機制在纖維化的進展中是不可或缺的，盡管炎癥在纖維化過程中僅僅起了很小一部分作用。

腸纖維化表現為過度的、異常的ECM沉積，其中膠原蛋白在ECM表達最豐富［8］。有研究表明［9］，在腸纖維化部位可見大量成纖維細胞，Ⅲ型膠原的合成能力明顯增加。TGF-β與纖維化發生發展具有一定關系。有研究表明［10］，TGF-β過度表達會促進ECM大量累積，是腸纖維化重要致病因素。CTGF是多種氨基酸組成多肽物質，對纖維化發生起重要作用。CTGF主要由TGF-β誘導表達，主要介導TGF-β發生纖維化［11］。研究表明［12-13］，在多種纖維化疾病中，TGF-β與CTGF表達協同增加，當CTGF表達減少時，TGF-β促進纖維化作用明顯減弱。由此可見，CTGF與纖維化呈相關性。所以通過干預結腸組織TGF-β與CTGF表達研究腸纖維化具有重要意義。

根據葉天士“久病入絡”“久痛入血”理進行辨證論治，絡脈是氣血津液輸布、環流的樞紐和通路，主要參與營血的生成、輸布和貫通營衛、溝通表里經脈的生理功能。《外科正宗·腸癰論》曰“腸癰，皆濕熱瘀血流入小腸而成……如積襲日久……以致毒攻內臟，腸胃受傷”。可見濕、熱、瘀、毒是腸炎腸纖維化病理因素，蘊結腸腑，損傷血絡，氣血運化失司，組織滲灌不足，血敗肉腐。吳以嶺《絡病論》認為絡病有“易滯易瘀、易入難出、易積成形”的特點。《靈樞·癰疽》云“榮衛稽留于經脈之中，則血泣而不行，不行則衛氣從之而不通，壅遏而不得行，故熱，大熱不止，熱勝則肉腐，肉腐則為膿”。痰濕熱毒灼傷絡脈導致營衛之行受阻，氣機阻滯，引起血液運行澀滯、津血互換異常，使津凝成痰，血滯為瘀，代謝廢物蓄積為毒；痰、瘀、毒等病理產物聚積又引起絡脈瘀阻、閉塞，絡息成積，進一步損傷絡脈，加重絡脈自身營衛不通，形成絡脈病變的惡性循環，故補氣健脾藥常與清腸祛風、活血通絡藥同用。前期課題組認為脾氣虛弱是發病基礎［14-15］，熱和瘀是主要病理因素，而且制定了健脾清腸方治療，療效確切［16-17］。方中以黃芪和黃連共為君藥；黨參助黃芪健脾益氣，馬齒莧助黃連清解腸熱止痢為臣藥；佐以生地榆清熱涼血止血，三七化瘀止血，白及護膜止血，木香理氣消脹；生甘草清熱解毒，調和諸藥。諸藥共奏健脾益氣、理氣止痛、散瘀止血的功效。

由于該病病情遷延難愈，中醫認為病邪內蘊與正氣消伐并存，屬本虛標實。基于以上認識，提出腸纖維化以健脾清腸，活血通絡，扶正祛邪為主，創制健脾清腸通絡方。該方是在前期健脾清腸方基礎上加三棱、莪術，此2味藥是三棱丸的重要組成，具有活血化瘀作用，記載于清朝著名醫家姚俊的醫作《經驗良方》。方中三棱苦平辛散，為血中氣藥，長于破血中之氣，具有破血通經之效。現代藥理研究［18-20］發現，三棱提取物通過減少纖維組織增生、阻止纖維化發展，促進纖維組織降解起到抗纖維化作用；莪術苦辛溫香，入肝脾氣分，為氣中血藥，善破氣中之血，具有破氣消積之效，且其有效成分姜黃素可通過多種機制和途徑介導發揮其抗纖維化作用［21-22］；二藥配伍使用，氣血雙施，活血化瘀、行氣止痛、化積消塊力彰。三棱與莪術配伍能促進過氧化物酶增殖物激活受體γ生成，降低腸道纖維化因子的生成水平，從而抑制腸纖維化發揮治療作用。

本研究結果表明，模型組小鼠TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白表達增加，經過健脾清腸通絡方和美沙拉嗪干預后，結腸組織TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白的表達降低。由此可見，健脾清腸通絡方可能通過降低TGF-β 1、CTG、PCⅢ蛋白F表達來抑制腸纖維化。