6.25%精甲·咯菌腈懸浮種衣劑有效成分在大豆植株和根圍土壤中的降解動態及殘留分布

邢小霞，于 鑫，張清明，李平亮

（青島農業大學植物醫學學院山東省植物病蟲害綠色防控工程研究中心，山東青島 266109）

種衣劑是由農藥成分混合成膜劑等助劑加工制成的藥劑，其有效成分能夠隨種苗的生長而傳導至地上部分。同作用于葉面噴施或土壤處理農藥相比，種衣劑成分與土壤的接觸面積較小，且總用藥量低、持效期長，降低了對環境污染的程度和對非靶標生物的風險[1]。活性成分是種衣劑中的關鍵性功能成分，其在作物中的分布和消解行為，直接決定了種衣劑的用途和功效。雖然其能起到防蟲抑菌的功效，但有效成分還可能對作物的生長和環境造成一定的副作用[2]。例如，施用種衣劑后其造成的藥害，活性成分在作物上的殘留所引起的人畜膳食風險以及在土壤中的殘留造成的環境污染等[3]。因此，種衣劑有效成分的殘留分布和消解行為是影響其使用方法、作用效果和適用范圍的關鍵因素，也是了解藥劑作用機制、持效期和殘留風險的數據基礎，這對于藥劑的科學使用具有重要的指導意義。

亮盾是由先正達開發的一種高效低毒的種衣劑，由精甲霜靈和咯菌腈2種不同作用機制的殺菌劑組合而成，用來防治大豆根腐病、水稻惡苗病、棉花立枯病、炭疽病等多種病害[4]。目前，已有報道精甲霜靈在辣椒、西瓜、西紅柿、煙葉、黃瓜以及馬鈴薯中的殘留動態與降解規律[5]；咯菌腈在辣椒、櫻桃、葡萄、番茄以及棉花等植株中的殘留動態[6-8]。然而，關于精甲霜靈與咯菌腈作為種衣劑成分，在大豆植株中殘留分布和降解動態的研究尚未見報道。

大豆是我國主要的糧油作物，其產量與質量關乎國家糧食安全。大豆根腐病作為世界性土傳病害，會危害大豆生產的整個生命周期，造成大豆產量嚴重降低，因此研究防治大豆根腐病主要種衣劑在大豆植株中的殘留分布規律、評價其安全性具有重要意義。本研究將商品化農藥亮盾（6.25%精甲·咯菌腈種衣劑）應用于大豆種子處理，研究其有效成分精甲霜靈和咯菌腈在大豆植株及根圍土壤中的殘留動態，探索藥劑在大豆植株中的內吸傳導和降解行為規律，從殘留降解角度解釋藥劑的作用特點，旨在為該有效成分的種衣劑的科學應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-2030D PLus島津高效液相色譜儀，日本島津公司；渦旋振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造公司；離心機，湘儀離心機儀器有限公司；電子天平，西杰天平儀器有限公司。

精甲霜靈標準品（純度99%），成都化夏化學試劑有限公司；咯菌腈標準品（純度97%），上海皓鴻生物醫藥科技有限公司；乙腈（分析純），濟南世紀通達化工有限公司；PSA（乙二胺-N-丙基甲硅烷）、弗羅里硅土，博納艾杰爾試劑公司；甲醇（色譜純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 試驗材料

供試品種：大豆品種為‘齊黃28’。

供試藥劑：亮盾（6.25%精甲·咯菌腈）懸浮種衣劑，先正達中國投資有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設計

播種前，將大小一致的大豆種子用6.25%精甲·咯菌腈懸浮種衣劑拌種。根據包裝推薦劑量，設定試驗的用量為每100 g種子0.40 mL制劑，用蒸餾水稀釋10倍后，均勻覆蓋于種子表面，并小心攪拌，晾干等待播種。將拌有種衣劑的種子種植在盆口直徑為20 cm的花盆中，每盆種10粒種子，并于25℃、光暗比為12∶12、光照強度為20000 lx條件下的光照培養箱中培養，每3 d澆水1次，維持土壤含水量在20%左右。藥劑處理種子種植30盆，以未施用藥劑的大豆種植盆作為對照，對照為5盆。根據大豆植株長勢及取樣量的要求，于種植后的1、3、5、7、10和14 d翻土收取大豆種子殘部樣品，取樣量為5 g，取3個重復；于7、10、14、21和28 d挖取根系周圍土壤樣品（在距離根系5 cm范圍內）及大豆整株植物，其中土壤樣品先在通風櫥通風快速晾干，去除植物根系等雜物后用80目篩成較細顆粒，取樣量為10 g，取3個重復；挖取的大豆植株經清洗和晾干后，分離根系和葉片樣品，根、葉樣品取樣量為5 g，取3個重復。以上所采集樣品均放置于自封袋，保存于-80℃冰箱。

1.3.2 樣品前處理

大豆樣品提取：準確稱取1.00 g液氮磨碎的大豆粉末樣品（種子、植株和根系）置于試管中，加入5 mL二氯甲烷，渦旋震蕩萃取1 min，水浴超聲萃取10 min，隨后在4℃靜置2 h。于5000 r/min離心10 min，加入無水硫酸鈉1.0 g，取上清液轉移至離心管，用氮吹儀在45℃條件下快速吹干。吹干后，先在離心管中加入1.00 mL乙腈，渦旋震蕩1 min，再加入PSA和弗羅里硅土各50 mg，再次渦旋震蕩混勻。隨后于10000 r/min條件下再次離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜，待測。

土壤樣品提取：稱取10.00 g土壤樣品，置于含有10.00 mL乙腈溶劑的試管，渦旋1 min，隨后在4℃靜置2 h。取1.00 mL上清液于離心管中，再分別加入PSA和弗羅里硅土各50 mg，渦旋震蕩混勻，于10000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜，待測。

1.3.3 色譜測定條件

島津InertSustain C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；柱溫：25℃；進樣量：20 μL；檢測器：PDA；檢測波長：220 nm；流速1.0 mL/min。采用梯度洗脫，流動相為A（甲醇）和B（超純水）：0～5 min，A：15%；5～9 min，A：15%線 性 增 加 至100%；9～11 min，A：100%線性減少至95%；11～15 min，A：95%線性減少至15%；15～20 min，A：15%。

1.3.4 標準曲線制作

在上述色譜測定條件下，以峰面積（y）為縱坐標，以進樣的質量濃度（x）為橫坐標分別繪制精甲霜靈和咯菌腈的標準工作曲線。

2 結果與分析

2.1 分析方法的建立

2.1.1 分析方法的優化

大豆、土壤樣品中精甲霜靈和咯菌腈的提取參考已報道的方法[9]，并將其進行了優化。結果表明，每毫升大豆植物提取液加入50 mg PSA和50 mg弗羅里硅土時，2種殺菌劑的加標回收率均不低于80%；對大豆樣品提取液的凈化效果較好，尤其是用于處理根部和葉部樣品時，加入2種凈化填料可顯著降低提取液的顏色，降低色素相關雜質干擾。

對于配備紫外檢測器的液相色譜儀，定量檢測波長的選擇對于方法的靈敏度和選擇性至關重要。精甲霜靈和咯菌腈的紫外掃描圖（圖1）表明，2種殺菌劑的紫外信號強度隨著波長的增加而減弱，但分別在267和265 nm處有較弱的吸收峰。200 nm處峰信號較強，但接近溶劑截止波長，干擾較多，綜合光譜圖中波長與紫外信號強度的關系，確定定量檢測波長為220 nm。

由于精甲霜靈和咯菌腈極性有差異，且凈化劑處理過的提取液仍有各類雜質植物代謝成分，可能對2種殺菌劑的分離形成干擾，所以有必要對色譜分離參數進行優化。結果顯示，采用梯度洗脫方法，峰容量較大，可使得極性、非極性物質先后被洗脫，且各個雜質不與精甲霜靈和咯菌腈的峰重合。在最佳儀器條件下，精甲霜靈和咯菌腈標樣、大豆提取液空白、大豆提取液添加精甲霜靈和咯菌腈標樣、土壤提取液空白和土壤提取液添加精甲霜靈和咯菌腈標樣的色譜圖分別見圖2。由圖可知，單個樣品檢測的總時長為20 min，精甲霜靈和咯菌腈的保留時間分別為10.99和11.68 min。

2.1.2 方法的線性、靈敏度和回收率

由于大豆種、根、葉均屬植物樣品，為降低方法驗證的工作量，本研究將3種未添加殺菌劑的樣品粉末按質量比1∶1∶1混合作為大豆基質，用于研究和驗證方法的定量限、添加回收率等。采用建立的樣品前處理和儀器檢測方法，對分析方法的線性范圍、靈敏度和回收率進行了驗證。結果表明，精甲霜靈在0.35～50.0 mg/L范圍內的線性方程為y=67503x-12471（R2=0.9912）；咯菌腈在0.15～50.0 mg/L范圍內的線性方程為y=117740x+19514（R2=0.9951）。大豆樣品中精甲霜靈和咯菌腈的定量限分別為0.35和0.15 mg/kg；土壤樣品中的定量限則分別為0.20和0.10 mg/kg。此外，大豆和土壤樣品中精甲霜靈的平均回收率為84%～97%；咯菌腈的平均回收率為80%～95%，相對標準偏差（RSD）均小于7%（表1）。以上結果表明，大豆和土壤基質中2種藥劑殘留分析的線性關系較好，靈敏度和回收率較高，符合農藥殘留檢測需求。

表1 大豆和土壤樣品中精甲霜靈和咯菌腈的添加回收試驗結果（n=5）

2.2 殘留降解動態

2.2.1 精甲霜靈的殘留降解動態

精甲霜靈在大豆種子、葉片、根部和根圍土壤中的殘留降解動態如圖3所示。由圖可知，種子、葉片、根中精甲霜靈的初始含量由大到小依次為種子＞根＞葉片；在三者中的含量變化趨勢均為隨時間減少，其中在14和21 d時根、葉中的含量低于檢出限；種子中初期降解速度較快，后期變慢，但總體降解速度慢于根、葉。作為包衣處理的受藥部位，種子中的藥劑成分含量一般最高。大豆種子進行包衣處理后，由于施用劑量較大，未能全部滲透進入種子內部，有一部分精甲霜靈附著于種子表面，保護種子在發芽階段免受卵菌等有害病原侵襲，因而種子檢測到的精甲霜靈應是種子內外含量之和。精甲霜靈是一種內吸傳導活性較強的殺菌劑，進入種子內部的藥劑成分會隨著大豆的發芽和幼苗的生長藥劑成分進入根、葉等其他部位。相較于葉部，根部含量較大的原因可能是傳導可能存在2種途徑，即種子向根部 的劑量轉移，以及根部對周圍土壤中藥劑的吸收。

根圍土壤中精甲霜靈也表現隨時間逐漸降解的特征，但28 d時仍保持了一定含量。這表明精甲霜靈具有一定的淋溶性，殘留在種子表面的藥劑，會持續向周圍土壤擴散，其含量大小取決于擴散至土壤中的速度和土壤中降解速度。擴散至土壤中的藥劑，一部分繼續被附近大豆根系吸收，與從種子轉到根系的藥劑一起保護植株抵抗病原微生物；另一部分被土壤保留。殘留在土壤中的藥劑具有抑制一些土傳病原物的功能，但也可能對一些有益土壤生物，如蚯蚓，產生危害[10]。

2.2.2 咯菌腈的殘留降解動態

咯菌腈在大豆種子、葉片、根部和根圍土壤中的殘留降解動態如圖4所示。由圖可知，與精甲霜靈一樣，種子中的咯菌腈也呈現含量隨時間減少的趨勢，但前3 d降解速度較快，從4.89 mg/kg降至1.82 mg/kg，之后降解速度變緩，至14 d時仍維持一定含量（0.40 mg/kg）。不同于精甲霜靈的含量變化特點，咯菌腈在根中的含量均表現為先增加、后減少，根部的藥劑平均含量遠高于葉部。葉部的咯菌腈含量低于精甲霜靈，說明精甲霜靈對葉部的保護作用相對較強。根部中咯菌腈含量以較高水平維持較長時間，而精甲霜靈在14 d后含量低于定量限，表明保護根部的主要藥劑成分是咯菌腈。作為一種非內吸或弱內吸輸導的藥劑，咯菌腈由種子向根的劑量轉移主要來源于根對根圍土壤藥劑的吸收和附著，而葉片中的較低含量則可能來源于種子發芽階段胚芽中的殘留。

根圍土壤中咯菌腈的含量呈現緩慢減少的趨勢，含量維持相對穩定至28 d（0.583～0.502 mg/kg）。根圍土壤中咯菌腈的含量動態主要與種子表面藥劑脫落擴散至土壤中的藥量和藥劑降解速度有關，還和取樣土壤與種子的距離有關。根圍土壤中農藥的持續存在，一方面有利于抑制土壤中的病原菌，維持大豆種子發芽和幼苗生長的安全環境；另一方面其殘留也可能影響土壤生態環境。

2.2.3 2種有效成分的降解動力學分析

采用已報道的數學模型[11-12]，對精甲霜靈和咯菌腈在大豆種、葉、根、土中的殘留降解動態數據進行了擬合回歸，結果顯示：精甲霜靈在4種基質中的降解動態均各符合一級農藥降解動力學模型Ct=C0e-kt，擬合曲線和擬合方程分別見圖3 A、B、C和D，擬合度（R2）均大于0.84，種、葉、根、土中的半衰期（DT50）分別為1.097、4.884、1.798和13.69 d；咯菌腈在種子、葉片和土壤中的降解動態也符合一級農藥降解動力學模型，擬合曲線和擬合方程分別見圖4A、B和D，但擬合度較差（0.3381＜R2＜0.7476），DT50值分別為1.908、5.698和103.2 d；咯菌腈在根部呈現先增加后減少的特征，符合一級農藥累積-消解動力學模型Ct=IF［t＜tmax，C0ek1t，Cmin+（C0ek1t-Cmin）e-k2（t-tmax）］，擬合曲線見圖5C，擬合方程為Ct=IF［t＜14.11，0.8887e0.07180t，0.9356+（0.8887e0.07180t-0.9356）e-0.1464（t-14.11）］，R2=0.7605，含量峰值為0.8887 mg/kg，達峰時的時間為施藥后14.11 d，峰值后降解半衰期為4.733 d。以上結果表明，精甲霜靈和咯菌腈在土壤中降解速度最慢，在種子中降解速度最快；咯菌腈在土壤中的殘留期長于精甲霜靈在土壤中的殘留期，精甲霜靈在葉片中的降解速度慢于根部，咯菌腈在根部有一個含量峰值，即先累積后降解。

2.2.4 2種有效成分的分布特點

種衣劑防控持效期及其殘留安全性除了與有效成分的初始含量、降解速度和半衰期有關外，還與在植株不同部位和根圍土壤中的分布密切相關。本文采用Graphpad Prism進行了種植后第7 d 2種有效成分的部位平均含量分布的餅狀圖特點分析。結圖5所示，精甲霜靈大部分累積于大豆根部（占比73.1%），種子、葉片次之，土壤中最少；咯菌腈同樣主要累積于根部，但占比相對較低（占比49.8%），其次累積部位是種子，在土壤中的量遠大于葉部。以上結果表明，雖然種子部位是種衣劑處理的部位，未種植前承載著100%的藥量，但隨著大豆種子發芽和幼苗生長，2種有效成分可通過滲透、內吸、傳導等多個途徑進入與種子鄰近的根系及根圍土壤，與種子相距相對較遠的葉片，維持一定的劑量來滿足防控病原菌的需求。精甲霜靈的內吸傳導性較強，較多地被傳導至根、葉部位；咯菌腈非內吸或弱內吸，主要殘留于種子表面，而后因土壤水分的淋溶作用進入根圍土壤，部分土壤中咯菌腈則進一步被根系吸收。

3 結 論

通過優化前處理步驟和色譜儀器分析參數，本文建立了大豆植株和根圍土壤中精甲霜靈和咯菌腈的HPLC分析方法。該分析方法線性范圍適中，靈敏度和選擇性較好，回收率滿足農藥殘留檢測要求。將精甲·咯菌腈包衣的大豆種子種植后，2種有效分均可被大豆植株的根、葉所利用，用來保護自身的生長免受大豆病原菌的侵染。其中，精甲霜靈具有較強的內吸傳導性，主要保護大豆葉片，而咯菌腈內吸性弱，主要對根部起保護作用。種衣劑2種有效成分在大豆植株和根圍土壤中的殘留降解動態符合一級農藥降解動力學或一級農藥累積-降解動力學模型，且兩者在種子中的降解速度最快，而在土壤中降解速度最慢。本研究初步揭示了6.25%精甲·咯菌腈懸浮種衣劑的有效成分精甲霜靈和咯菌腈在大豆植株和根圍土壤中的殘留分布和降解規律，并從藥劑劑量分布的角度解釋了該藥劑的作用特點，所得研究結果有助于為指導該藥劑的科學應用提供重要參考。