假基因POU5F1B 在結直腸癌組織中的表達及其臨床意義

段達榮，蔡莎莎，林芯伊

（臺州市第一人民醫院檢驗科，浙江 臺州 318020）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種常見的惡性腫瘤，是危害人類健康的主要惡性腫瘤之一[1]，在西方發達國家中高發。隨著我國人們生活水平提高，結直腸癌發病率亦逐年上升，其病因和發病機制目前尚不完全清楚，普遍認為結直腸癌的發生、發展與遺傳和環境等多種因素導致基因改變有關[2-4]。結直腸癌患者5 年生存率為50%～60%，早期準確診斷對提高患者的生存率至關重要。但是目前對結直腸癌尚缺乏較好的早期診斷和療效判斷指標。本研究利用轉錄組測序技術（RNA-Seq）分析假基因POU5F1B（POU domain class 5 transcription factor 1B，POU5F1B）與結直腸癌的發生的關系，旨在為臨床診斷和治療提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017 年1 月-2021 年10 月臺州市第一人民醫院收治的進行手術切除并經病理證實的143 例結直癌患者臨床病理資料及術后標本。其中男90 例，女53 例；年齡55～81 歲。所有直腸癌標本經病理檢查證實為原發性直腸癌，癌旁組織標本為距離腫瘤2 cm 外的結直腸組織，病理組織學檢查均證實為無癌變。本研究經本院倫理委員會通過，患者或其家屬簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準 納入標準：①結直腸癌診斷符合《中國結直腸癌診療規范（2017 年版）》標準[5]。②所有的患者均為初診，且按標準化結直癌手術治療；③術后的病理診斷證實為結直腸癌，同時根據AJCC 第7 版TNM 分期標準進行分型；④采集樣本前患者未接受任何靶向抗腫瘤、新輔助放化療等治療。排除標準：患者有血液病、其它部位的腫瘤或者其它部位轉移引起的結直腸癌等疾病不在本研究范圍。

1.3 儀器與方法

1.3.1 儀器 4 ℃、-20 ℃冰箱（青島海爾公司）；-80 ℃冰箱（日本三洋公司）；全自動圖像分析系統/凝膠成像儀RED（美國Proteinsimple 公司）；高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；光學顯微鏡（日本Olympus）。

1.3.1 RNA-Seq 檢測 收集原發性結直腸癌組織標本、相應的癌旁組織標本送至北京諾禾致源科技股份有限公司應用轉錄組測序技術（RNA-Seq）進行檢測，使用cBioPortal for Cancer Genoics 軟件進行分析。

1.2.2 免疫組化染色 將結直腸癌組織及癌旁組織切片常規脫蠟入水后進行免疫組化染色，檢測POU5F1B 細胞的表達情況。免疫組化實驗步驟按二步法組化檢測試劑盒說明書進行。一抗稀釋比例均為1∶100 以PBS 代替一抗為陰性對照。免疫組化染色具體步驟：組織及時適當取材、充分固定，石蠟包埋、完整切片（厚度4～6 μm），載玻片需經清洗和防脫片處理。放入70 ℃電熱恒溫干燥箱烤片1 h。石蠟切片脫蠟、水化。脫蠟要徹底，室溫較低時在37 ℃溫箱中進行脫蠟或適當延長時間。用PBS（pH7.4）沖洗3 次，5 min/次。EDTA 抗原修復液直接煮沸抗原修復法對組織進行相應的修復。PBS 沖洗3 次，5 min/次。加入過氧化酶阻斷溶液，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS 沖洗3 次，5 min/次。加1～2 滴POU5F1B 抗體，放入專用孵育盒內，在32 ℃水浴箱內孵育1 h。PBS 沖洗3 次，5 min/次。加聚合物增強劑（第二抗體），放入專用孵育盒內，在32 ℃水浴箱內孵育30 min。PBS 沖洗3 次，5 min/次。加2 滴新鮮配制的DAB 溶液，在顯微鏡掌握顯色時間。自來水沖洗，蘇木素復染，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。

1.4 結果判定 在光鏡下結合染色強度和陽性細胞百分比判斷POU5F1B 蛋白陽性表達率。以腫瘤細胞胞漿上出現棕褐色顆粒為陽性表達，染色愈濃代表陽性表達愈強。選取背景清晰的視野，在100 倍顯微鏡下觀察，按組織染色深淺分為：未染色記作0分；淺黃色記作1 分；棕黃色記作2 分；棕褐色記作3 分。選取染色均勻的區域于400 倍顯微鏡下觀察，記錄5 個視野中陽性細胞的百分比，計算其平均值。按染色細胞的比例分為4 分：0～25%記作0 分；25%～50%記作1 分；50%～75%記作2 分；＞75%記作3 分。組織染色強度與染色細胞百分比級別之乘積：＜3 分為陰性，3～6 分為陽性，＞6 分為強陽性。應用Imagepro-Plus6.0 圖像分析軟件對所有免疫組化指標的染色強度及面積進行計算分析。隨機選取3 個視野通過圖像分析軟件提取免疫組化指標的積分光密度值（IOD），取其平均值代表POU5F1B 指標的陽性表達水平。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0 統計學軟件進行數據分析。計數資料使用（n）表示。計量資料使用（）表示，兩組比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 假基因POU5F1B 在結直腸癌組織、癌旁組織中表達的比較 用RNA-Seq 檢測發現結直腸癌組織有1520 個差異基因（上調基因有989 個，下調基因有531 個），同時發現POU5F1B 基因位于染色體8q24 上，在直腸癌組織、癌旁組織這兩組倍數變化（log2FoldChange）為4.544，兩組中表達差異的顯著性水平（-log10padj）為12.569，POU5F1B 基因為上調基因，并且顯著高于其它基因，結直腸癌組織與癌旁組織有顯著性差異（P＜0.05），見圖1。

圖1 RNA-Seq 檢測結直腸癌組織與癌旁組織不同基因表達火焰圖

2.2 結直腸癌及癌旁組織中假基因POU5F1B 表達情況 對143 例結直腸癌及癌旁組織進行組化染色，根據免疫組化指標的染色強度及面積進行計算，結果癌組織中假基因POU5F1B 表達為（1.51±0.68），癌旁組織為（0.34±0.54），差異有統計學意義（P＜0.05），如圖2。

圖2 結直腸癌組織及癌旁組織中假基因POU5F1B表達情況

2.3 結直腸癌及癌旁組織假基因POU5F1B 組化染色情況 對癌旁組織及癌組織進行組化染色，癌旁組織細胞胞漿不著色或淺黃色，為不表達或低表達，癌組織細胞胞漿呈棕黃色，占比約80%，為高表達，見圖3。

圖3 結直腸癌及癌旁組織POU5F1B 組化染色情況

3 討論

根據國際癌研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）2018 年公布數據顯示，結直腸癌作為一種常見的癌癥在男女發病率分別排第3 名和第2 名[6]，死亡率占所有腫瘤死亡的8%。隨著社會經濟的發展，人們的生活水平不斷提高，飲食的結構發生變化，結直腸癌發病率在逐漸上升[7-9]。目前，結直腸癌治療方法主要有主要以手術和化療為主，但不可避免出現術后及化療后的復發，導致治療失敗，甚至患者死亡。研究顯示[10-12]，淋巴結轉移可以導致結直腸癌復發并對預后及生存產生影響。因此，如何預防治療過程中的淋巴結轉移，對延長患者的生存時間意義重大。本研究顯示，假基因POU5F1B 在腫瘤細胞中的表達高低與淋巴結轉移及生存時間有關，其對預后有重要的臨床意義。

假基因POU5F1B 位于染色體8q24 上，具有促進細胞生長和編碼功能蛋白的能力，與癌基因的激活、抑癌基因的失活、堿基錯配修復及修飾基因的突變等在細胞癌變過程中發揮重要作用，最終引起組織病理學的變化及相關基因、蛋白質的改變[13-15]。假基因POU5F1B 是細胞多能性的主要調節劑，不僅在胚胎發生過程中而且在腫瘤發生過程中都發揮重要作用[16，17]。有研究表明假基因POU5F1B 的表達與預后呈負相關，只有在睪丸生殖細胞腫瘤中表現為正相關[18]，也有研究發現發現假基因POU5F1B 表達水平與胰腺癌和肝臟細胞癌的惡性程度均呈正相關[19]。Pan Y 等[20]也發現假基因POU5F1B 在肝癌細胞株中高表達，并且POU5F1B 表達水平與患者的不良預后呈正相關。本研究在結直腸癌患者中也發現假基因POU5F1B 在結直腸癌組織中表達升高，表達高低與腫瘤惡性程度呈正相關性，也與病情的轉歸呈相關性，說明POU5F1B 在結直腸癌表達機制與其它消化道腫瘤相似。在134 例患者中，無圍術期死亡發生，術后隨訪期間8 例發生復發或轉移，對這8 例患者結直腸癌組織進行免疫組化染色，并應用Imagepro-Plus6.0 圖像分析軟件對所有免疫組化指標的染色強度及面積進行計算分析發現，結直腸癌組織異常高于其它未發生復發或轉移者，說明假基因POU5F1B 與病情的轉歸、預后、生存時間呈相關性，可以有效評估患者生存時間及手術治療方案。然而，假基因POU5F1B 表達高低是否還與其它因素（如腫瘤細胞的AKT 磷酸化）有關，有待進一步研究。

綜上所述，假基因POU5F1B 在結直腸癌患者腫瘤組織中為上調基因，表達水平與腫瘤的惡性程度呈正相關，臨床可用假基因POU5F1B 表達水平評估患者結直腸癌腫瘤的惡性種度。