鎘污染對稻田土壤真菌群落結構及多樣性的影響

羅路云，蔣宏華，王殿東，鄭立敏，張德詠，曾軍，彭俊彩，張卓*

（1長江師范學院現代農業與生物工程學院，重慶 408100；2湖南省農業科學院蔬菜研究所，湖南長沙 410125；3湖南省農業科學院植物保護研究所，湖南長沙 410125；4新疆農業科學院微生物應用研究所，新疆烏魯木齊 830000；5湖南省農業裝備研究所，湖南長沙 410125）

0 引言

【研究意義】重金屬在自然界中廣泛存在，在自然環境中難以降解，易沉積到土壤、水底被生物吸收，并進一步通過食物鏈累積而危害人體健康（Olaniran et al.，2013）。鎘是毒性最強的重金屬元素之一，能占用其他必需元素金屬離子的運輸通道，導致植物對營養元素的吸收及代謝活性降低，抑制植物生長（Kaur and Garg，2018；Menahem and Meni，2018）。鎘污染對作物生長、土壤微生物及土壤酶活性均具有不同程度的影響（廖潔等，2017；謝朝等，2020）。研究表明，鎘在土壤中被生物體吸收積累后，通過與土壤酶—底物復合物相互作用使酶蛋白變性或與蛋白活性基團相互作用來降低酶活性，進而通過影響微生物細胞合成酶來干擾土壤生物的正常生命活動（徐佳慧等，2020）。水稻是我國重要的糧食作物，目前我國水稻農田仍存在嚴重的鎘污染問題，降低鎘在土壤中的生物有效性和阻止其經由水稻根系向地上部及稻米遷移變得非常重要（Hrynkiewicz et al.，2018）。因此，探究不同程度重金屬污染下土壤微生物的變化對篩選可供生物修復的耐重金屬微生物具有重要意義。【前人研究進展】自然情況下鎘在土壤中濃度較低，但含鎘肥料及農藥的使用及采礦和冶煉等均會增加土壤中的鎘含量（Liu et al.，2007；史曉凱等，2014）。研究發現，微生物與植物協同作用能在一定程度上吸收和富集有毒重金屬（Wang et al.，2018；Zhang et al.，2018）。重金屬對土壤微生物在短期內的影響主要傾向于降低微生物多樣性，污染嚴重的土壤中細菌通常具有更低的豐富性、均勻性和多樣性特征（Luo et al.，2019）。Rajapaksha等（2004）研究了不同濃度鋅或銅污染對土壤微生物活性的影響，結果表明細菌活性隨著重金屬污染水平的升高而降低，然后慢慢恢復到與對照土壤相似水平，真菌活性隨重金屬污染程度的增加而增加。王奧等（2011）研究發現，鎘脅迫改變了紫色土細菌群落結構而對沖積土的細菌群落結構影響較小，高濃度鎘脅迫均顯著降低了各類可培養微生物數量。謝學輝等（2012）研究發現銅礦尾礦土壤中微生物多樣性除與有機碳、有機質、含水率等相關性較高，還受多種重金屬的影響，而在樣品中含量普遍比較高的重金屬如銅、鎘等并不是影響微生物多樣性的主要因素。Bourceret等（2016）將種植紫花苜蓿的地塊與裸露地塊進行比較，發現短期的重金屬污染通常會降低土壤微生物多樣性，但隨著時間推移，微生物多樣性慢慢升高。廖潔等（2017）研究發現高濃度鎘（濃度達100 mg/kg）能顯著抑制甘蔗的生長和產量，降低土壤酶活性，并顯著降低土壤中真菌、細菌和放線菌數量。閆華等（2018）研究發現，不同程度重金屬污染對稻田土壤真菌群落結構有顯著影響，且隨著污染程度的增加，抗逆真菌如類球囊霉屬（）、四枝孢霉屬（）、根囊壺菌屬（）等的相對數量和種類顯著增加，敏感真菌如被孢霉屬（）、木霉屬（）、離殼菌屬（）和菇屬（）等的相對數量急劇減少。Luo等（2019）研究發現鎘脅迫可改變稻田土壤細菌群落，鎘污染水平越高，土壤細菌多樣性越低，同時發現放線菌屬（）對鎘具有較強的耐受性。王寧等（2021）研究表明，鎘脅迫可提高苗期小麥根際土壤中細菌群落的多樣性，改變細菌群落結構。【本研究切入點】目前，前人研究主要集中在耐重金屬土壤微生物分離篩選及污染土壤的微生物修復，但在長期重金屬污染的田間環境中真菌群落結構隨重金屬污染程度的變化還需進一步研究。【擬解決的關鍵問題】以湖南某鎘礦周邊不同鎘污染程度（高、中和低）水稻田為研究對象，采集土壤樣品，測定土壤養分含量，利用Illumina MiSeq高通量測序技術分析土壤真菌群落結構，對比不同鎘污染組土壤真菌群落多樣性和群落結構差異，探究鎘脅迫對稻田土壤養分含量、土壤真菌群落結構及多樣性的影響，為闡釋鎘脅迫對稻田土壤微生物多樣性的影響規律提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于湖南省湘潭市某鎘礦區附近，采樣點在取樣前種植同一品種水稻，均進行相同的田間農事管理。試驗地光能資源豐富，歷年平均日照時數1700 h左右，全年平均氣溫17℃左右，降水量1400 mm左右。

1.2 樣品采集

選取該礦區及其周邊1 km的7個相鄰水稻田作為研究對象，采樣點分別命名為TZ、HX、HX1、SA、QN、XT和YT。每個水稻田采集8個生物重復樣品，每個重復設置1 m×1 m樣方，采用五點抽樣法收集20 g土壤樣品作為一個重復樣品。根據GB 15618—2018《土壤環境質量標準 農用地土壤污染風險管控標準》以及樣品組總鎘濃度差異，分別將其劃分為高鎘組（H：TZ采樣點，總鎘含量＞3.0 mg/kg），中鎘組（M：HX和HX1采樣點，總鎘含量0.3～3.0 mg/kg）和低鎘組（L：SA、QN、XT和YT采樣點，總鎘含量＜0.3 mg/kg）。移除土壤樣品中的植物材料、沙子和石頭，將樣品置于4 °C冷藏器并運送至實驗室。篩選和均質化樣品，將每個土壤樣本進一步分為2組，第1組風干后用于理化性質測定，第2組儲存在-80 °C冰箱用于DNA提取。

1.3 理化性質測定

按照國家標準GB/T17141—1997《土壤質量鉛、鎘的測定 石墨爐原子吸收分光光度法》和GB/T23739—2009《土壤質量 有效態鉛和鎘的測定 原子吸收法》的方法測定總鎘（TCd）和有效鎘（ACd）含量。采用玻璃電極測量土壤pH（土水比1∶25）。土壤全氮、全磷、全鉀、速效磷、速效鉀含量測定參考Jiang等（2016）的方法，微量凱氏定氮法測定土壤總氮含量，HClO-HSO消化法測定土壤全磷和全鉀含量，鉬藍比色法測定速效磷和速效鉀含量。土壤有機質含量采用濕氧化法測定（Luo et al.，2019），土壤堿性水解氮采用堿性水解氮法測定（鮑士旦，2005）。

1.4 土壤樣品DNA提取、PCR擴增和測序

每個樣品準確稱取0.5 g，使用Fast DNA SPIN Kit for Soil試劑盒（MP Biomedicals，USA）提取土壤樣品總基因組DNA。使用NanoDrop 2000測定樣品總DNA濃度和純度，純度A260/A280值要求在1.8～2.0。所有樣品基因組DNA濃度在擴增前定量到30 ng/μL，-20℃冰箱保存。以樣品基因組DNA為模板，選用gITS7（5'-GTGARTCATCGARTCTTTG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對樣品進行擴增（Kong et al.，2020）。PCR反應體系50.0μL：5.0μL 10×PCR buffer（含20 mmol/L MgCl），1.5μL dNTP（10 mmol/L），1.0 UDNA聚合酶，1.0μL DNA模板，滅菌ddHO補足至50.0μL。PCR擴增程序：94℃預變性1 min；94℃20 s，57℃25 s，68℃45 s，進行38次循環；最后68℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，純化PCR產物送至北京新科開源基因科技有限公司進行二代高通量測序（Illumina Hiseq 2500，讀長為PE250）。

1.5 數據分析

原始序列經雙端拼接、過濾和去除嵌合體后，得到優化序列（Edgar et al.，2011；Kong，2011；Mago?and Salzberg，2011）。調用UPARSE程序（Edgar，2013）在97%序列相似度水平下劃分OTU，得到OTU表和代表序列。通過RDP-Classifer（Version 2.10）調用Unite數據庫對OTU序列進行物種注釋，得到OTU代表序列各分類水平的物種分類信息。通過標準化OTU表計算每個土壤樣品的香農指數（Shannon index）、辛普森指數（Simpson index）、豐富度（Observed richness）和豐富度指數（Chao1 index），以此評估不同土壤樣品組之間的α多樣性。使用基于Bray_curtis矩陣的加權主坐標分析（Principal co-ordinates analysis，PCoA）及多重響應置換程序（MRPP）、相似性分析（Anosim）和非參數檢驗方法（Adonis）等評估兩組間土壤樣品真菌群落的β多樣性。數據處理通過Galaxy平臺及其集成軟件（http：//rccc.ou.edu）完成。

1.6 統計分析

使用SPSS 22.0進行統計分析，通過基于Duncan算法多重比較后的單因素方差分析評估高鎘組、中鎘組和低鎘組之間土壤樣品α多樣性指數差異；基于Pearson相關系數分析理化性質與α多樣性之間的相關性。

2 結果與分析

2.1 不同鎘污染稻田土壤真菌OTU分析

原始數據經質控后共獲得2659590條高質量序列，序列數在18382～101542條，每組樣品在97%相似度下經標準化后共獲得3462條OTU。單組樣品OTU測序量達150000以上，稀釋曲線雖尚未趨于平緩，但測序量滿足數據分析要求（圖1）。

為進一步研究不同鎘污染組間共有及特有OTU，構建不同鎘污染組OTU分析韋恩圖（圖2）。根據差異OTU分析結果，發現不同處理組樣品共有OTU數為619，高鎘組、中鎘組和低鎘組的特有OTU數分別為76、318和1290。高鎘組與中鎘組共有OTU數為785，特有OTU數分別為177和961；中鎘組與低鎘組的共有OTU數為1262，特有OTU分別為484和1391；高鎘組與低鎘組的共有OTU數為720，特有OTU數分別為242和1933。

2.2 不同鎘污染稻田土壤真菌α和β多樣性分析

2.2.1 土壤真菌α多樣性分析對高鎘組、中鎘組和低鎘組水稻土壤真菌α多樣性進行分析，結果（圖3）表明，中鎘組和低鎘組稻田土壤的真菌香農指數、辛普森指數、豐富度指數均顯著高于高鎘組（＜0.05，下同）；稻田土壤的真菌Chao1指數在不同鎘污染組間均具有顯著差異，表現為低鎘組＞中鎘組＞高鎘組。由此可知，高鎘組、中鎘組和低鎘組稻田土壤的真菌α多樣性隨著鎘污染水平升高呈降低趨勢，高鎘組α多樣性顯著低于中鎘組和低鎘組，但中鎘組和低鎘組間差異較小。

圖1 不同鎘污染采樣點稀釋曲線Fig.1 Dilution curve of different cadmium pollution sampling sites

圖2 不同鎘污染組OTU分析Fig.2 OTU analysis among different cadmium pollution groups

2.2.2 土壤真菌β多樣性分析 使用基于Bray_curtis矩陣的加權主坐標分析及多重響應置換程序、不相似性分析和多元方差分析評估2個不同采樣點間土壤樣品真菌群落的β多樣性。加權主坐標分析結果（圖4）表明，低鎘組和中鎘組、高鎘組稻田土壤真菌群落分離明顯；中鎘組、高鎘組稻田土壤真菌群落距離較近，pCoA1和pCoA2共解釋31.87%的真菌群落變異，其中pCoA1解釋18.49%的土壤真菌群落變異，pCoA2解釋13.38%的土壤真菌群落變異。不相似分析結果（表1）表明，高鎘組土壤樣品真菌群落（TZ）與中鎘組（HX、HX1）、低鎘組（SA、YT、QN、XT）樣點間具有顯著或極顯著（＜0.01，下同）差異；中鎘組土壤樣品真菌群落（HX、HX1）與低鎘組（SA、YT、QN和XT）各樣點間也均具有極顯著差異；低鎘組土壤樣品真菌群落在YT和XT樣點間無顯著差異（＞0.05，下同），其他樣點間均具有極顯著差異；中鎘組HX和HX1樣點間土壤真菌群落差異極顯著。

2.3 不同采樣點稻田土壤真菌在門和屬分類水平的物種分析

在門分類水平上對每組樣品的相對豐度分布進行分析并繪制優勢物種相對豐度柱形圖（相對豐度＞1%），結果（圖5）顯示，不同土壤樣品中各門的豐度不同，但子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和被孢霉門（Mortierellomycota）在所有樣品組中均屬優勢菌門，相對豐度在51.09%～81.93%。高鎘組（TZ）的優勢門為子囊菌門、擔子菌門、Chlorophyta、被孢霉門和壺菌門（Chytridiomycota）；中鎘組（HX和HX1）的優勢門為子囊菌門、擔子菌門、Chlorophyta、被孢霉門和壺菌門；低鎘組中，QN樣點的優勢門為子囊菌門、擔子菌門、Chlorophyta、被孢霉門和壺菌門，SA和XT樣點的優勢門為子囊菌門、擔子菌門和被孢霉門，YT樣點的優勢門為子囊菌門、擔子菌門、Chlorophyta、被孢霉門和壺菌門。

對不同采樣點土壤真菌中平均相對豐度大于1%的屬進行差異分析，結果（表2）顯示，金孢屬（）在中鎘組和高鎘組的相對豐度顯著高于低鎘組；韌傘屬（）、籃狀菌屬（）、屬在高鎘組的相對豐度顯著高于中鎘組和低鎘組；被孢霉屬（）、枝鼻菌屬（）、小帶孢霉屬（）、木霉屬（）在中鎘組的相對豐度顯著高于低鎘組和高鎘組；屬在低鎘組的相對豐度顯著高于中鎘組和高鎘組；擲孢酵母屬（）、粉褶蕈屬（）、枝孢屬（）、、彎孢屬（）、和鏈孢霉屬（）在各鎘污染組的相對豐度無顯著差異。

圖3 不同鎘污染組稻田土壤真菌α多樣性分析Fig.3αdiversity analysis of fungi in paddy soil in different cadmium pollution groups

圖4 不同采樣點主坐標分析Fig.4 Principal co-ordinates analysis of different sampling sites

表1 不同采樣點不相似性分析Table 1 Dissimilarity analysis of different sampling sites

圖5 不同采樣點土壤真菌在門水平上的相對豐度Fig.5 Relative abundance of soil fungi at phylum level in different sampling sites

2.4 真菌群落結構與環境因子的相關分析

將土壤真菌群落結構與環境因子進行相關分析，結果（表3）表明，總氮和總鉀與土壤真菌群落結構無顯著相關性，pH、堿性氮、有效磷、有效鉀、總磷、有機質、總鎘及有效鎘均與土壤真菌群落結構呈極顯著正相關，表明這些環境因子均可影響土壤真菌群落。

為進一步了解土壤理化因子與真菌群落變化的對應關系，對不同鎘污染組土壤樣品的真菌群落進行CCA分析，結果（圖6）表明，第一軸（CCA1）和第二軸（CCA2）分別解釋30.06%和14.40%的真菌群落差異，共解釋44.46%的真菌群落變異。不同鎘污染組土壤樣品分離明顯，總鎘、有效鎘、總磷、有效磷、有機質與鎘脅迫下真菌群落的變化顯著正相關，pH、有效鉀、總氮、總鉀與真菌群落的變化顯著負相關。

3 討論

研究表明，短期重金屬污染脅迫會降低土壤微生物的豐度和多樣性（王奧等，2011；Bourceret et al.，2016）。本研究中，稻田土壤真菌α多樣性隨著鎘污染水平升高呈降低趨勢，高鎘組α多樣性顯著低于中鎘組和低鎘組，但中鎘組和低鎘組之間差異較小，表明鎘污染水平升高可降低土壤中真菌群落α多樣性，而中、低鎘組α多樣性差異較小，推測其原因可能是高濃度鎘脅迫下真菌更敏感；高鎘濃度下微生物多樣性均顯著降低表明菌株受重金屬脅迫時，活性氧自由基在細胞中累積，超過一定閾值即與膜質和生物大分子反應，從而破壞生物膜結構，這可能也是鎘脅迫下α多樣性降低的重要原因。

不同重金屬元素對土壤真菌群落結構的影響存在差異。閆華等（2018）研究4種重金屬污染對真菌群落的影響時發現，鉛和銅污染對真菌群落結構的影響最顯著，鎘次之，鋅的影響最小。許洪揚等（2021）發現與湖南省重金屬修復地方標準相比，采樣區4種重金屬鋅、鉛、鎘、銅的污染程度依次降低，重金屬污染顯著改變真菌群落的組成和結構。本研究中，基于Bray_curtis矩陣的加權主坐標分析和不相似分析結果表明，高鎘組、中鎘組和低鎘組稻田土壤的真菌群落具有顯著差異，表明鎘污染水平升高使土壤真菌群落發生顯著變化，鎘脅迫下改變了土壤真菌群落結構。同時，主坐標分析中pCoA1和pCoA2共解釋31.87%的真菌群落變異，表明鎘污染程度是真菌群落變異的重要因素之一。造成這種不同重金屬元素影響能力不同的原因可能是土樣的重金屬元素濃度、土壤類型和基本性質等存在差異，從而導致不同重金屬元素對微生物的毒性出現差異。

表2 不同鎘污染組優勢屬差異分析Table 2 Difference analysis of dominant genera in different cadmium pollution groups

表3 土壤真菌群落和環境因子的相關分析Table 3 Correlations between soil fungal community and environment factor

圖6 不同鎘污染組土壤樣品中真菌群落CCA分析Fig.6 CCA analysis of fungal community in soil samples from different cadmium pollution groups

微生物具有更大的表面積和更高的代謝活性，使其更易受土壤中重金屬的影響，重金屬可通過吸附、固定、絡合、溶解和氧化還原等方式阻礙其生態功能（Vodyanitskii and Plekhanova，2014；Li et al.，2015）。前人研究表明，鎘能通過與土壤酶—底物復合物相互作用來降低酶活性，進而影響土壤生物的正常生命活動（徐佳慧等，2020）。本研究中，子囊菌門、擔子菌門和被孢霉門在所有樣品組中均屬優勢菌門，但不同鎘污染組優勢菌門相對豐度具有顯著差異，表明鎘污染水平升高改變了土壤真菌種群。除此之外，本研究中高鎘組、中鎘組和低鎘組的特有OTU分別為76、318和1290個，表明隨著土壤中鎘濃度升高，土壤中特有真菌物種顯著降低，可能是因為鎘對微生物的毒害作用減少了土壤中真菌的種類。重金屬污染脅迫改變原有的群落內部種群競爭關系，導致耐性菌群快速生長，成為重金屬污染環境中的優勢種群（謝學輝等，2012）。許洪揚等（2021）發現敏感性真菌［球囊菌門（Glomeromycota）］的相對豐度隨重金屬污染程度的升高而降低，而耐受性真菌［子囊菌門、擔子菌門、被孢囊門（Mortierellomycota）、被孢菌屬（）、青霉菌屬（）和鐮刀菌屬（）］的相對豐度增加，但在重污染情況下有所減少。本研究中，韌傘屬、籃狀菌屬和屬在高鎘組的相對豐度顯著高于中鎘組和低鎘組，表明這些真菌對鎘具有一定的抗性。有研究表明，與植物根系相關（Hambleton et al.，2005），韌傘屬與植物氮積累相關（Philpott et al.，2014），但并未發現其與鎘污染相關。Zeng等（2020）發現高重金屬降低了土壤中的曲霉屬（）、鐮刀菌屬、柄孢殼菌屬（）和赤霉菌屬（）等真菌屬的豐度，極大增加了鏈格孢屬（）、莖點霉屬（）和外瓶霉屬（）等真菌屬的豐度。

重金屬污染土壤的細菌和真菌多樣性受到土壤理化性質的影響，土壤微生物群落結構與重金屬濃度均相關，同時與土壤參數也存在一定相關性。本研究中，總鎘、有效鎘、總磷、有效磷、有機質與真菌群落的變化顯著正相關，pH、有效鉀、總氮、總鉀與真菌群落的變化顯著負相關。土壤有機質和pH在決定鎘的溶解度和形態方面起重要作用，影響鎘的遷移率和生物有效性，有機質可通過形成穩定的絡合物固定鎘離子，從而降低鎘的生物有效性（徐佳慧等，2020）。在酸性土壤中，吸附在土壤顆粒上的氫離子會增加無機和有機土壤組分上的正電荷，導致土壤對鎘的吸收能力減弱，從而增加土壤生物對鎘的吸收。隨著鎘污染程度增加，土壤中總磷和有效磷顯著增加，將為作物提供更多的養分促進作物生長，在一定程度上緩解鎘對作物的脅迫（卓晨等，2020）。因此，重金屬濃度、理化性質、微生物三者之間相互影響，相互作用，共同形成了復雜的土壤環境。

4 結論

高濃度鎘污染可降低稻田土壤真菌群落的α多樣性并改變土壤真菌群落結構。子囊菌門、擔子菌門和孢霉門在所有樣品組中均屬優勢菌門，但不同鎘污染組優勢菌門相對豐度具有顯著差異。pH、堿性氮、有效磷、有效鉀、總磷、有機質、總鎘及有效鎘均與土壤真菌群落結構顯著相關，是影響土壤真菌群落結構的主要驅動因子。