應用近紅外光譜和化學計量法測定甜玉米種子活力

趙冰，王愛文，趙華

（1廣州國家現代農業產業科技創新中心/農業農村部華南現代生物種業重點實驗室，廣東廣州 510520；2山東大學藥學院，山東濟南 250012；3張掖市農業科學研究院，甘肅張掖 734000）

0 引言

【研究意義】甜玉米是普通玉米種子的淀粉合成基因突變形成的玉米變異類型，其種子活力普遍較低，但資源間存在明顯的遺傳變異，實現對育種材料種子活力進行快速、準確、簡便、有效地檢測，篩選高活力種質育種，可有效提高甜玉米育種效率（李武等，2018）。一般采用種子標準發芽試驗方法測定甜玉米種子活力，但該方法通常需要7 d才能完成數據采集，傳統方法無法滿足實時發布需求（Zhao et al.，2009）。四唑試驗是一種快速測定種子活力的方法，但具有一定破壞性。因此，有必要對甜玉米種子活力的快速、無損檢測方法進行升級研究。利用近紅外光譜技術（Near infrared spectroscopy，NIRS）進行種子活力測定，可達到快速、無損、準確的效果。這種高效率的種子活力檢測方法可顯著縮短檢測時間，減少檢測工作量，高效率地篩選高活力甜玉米種子，推動甜玉米種子活力篩選走向批量化和產業化。【前人研究進展】玉米種子的品質是其活力的體現，已有文獻報道NIRS在玉米品質檢測中的應用，Armstrong等（2011）利用NIRS檢測了單粒玉米種子的成分，包括蛋白質、油、淀粉和密度。種子活力是評價種子質量的重要參數，近年來受到越來越多的關注。Chen等（2014）利用傅里葉變換近紅外光譜（FTNIR）實現了玉米蛋白和脂肪的定量測定。Lee等（2017）利用NIRS對番茄種子活力進行快速無損分析，建立了預測模型并進行驗證，發現該模型對番茄具有較好的預測精度。Al-Amery等（2018）收集81個批次大豆種子的NIRS，為大豆種子批次的標準發芽和活力開發了基于NIRS的預測模型。Kusumaningrum等（2018）采用組合偏最小二乘判別分析（PLSDA）收集并分析大豆種子的FT-NIR光譜，對有活力和無活力的種子進行區分，同時進行變量選擇，結果發現PLS-DA算法利用所有變量或選定變量分析FTNIR光譜，預測的準確度較高。Qiu等（2018）利用PLS-DA區分有活力和無活力的超甜玉米種子，證明了作為活力測定非破壞性方法的可行性。金文玲等（2020）利用透射吸收光譜檢測系統結合PLS-DA鑒別模型對不同活力的水稻種子進行了分級。Fan等（2020）使用NIRS檢測單個小麥種子的活力，利用主成分分析（Principle component analysis，PCA）和連續投影算法（Successive projections algorithm，SPA）進行降維處理，并結合4種機器學習方法構建了8種預測模型，結果發現8種模型的準確率均超84.0%。Wang等（2020）基于自建種子單粒制粒裝置，利用NIRS探討了基于顆粒的種子活力檢測和分級的可行性。此外，還有研究者利用NIRS評估了辣椒種子（Mo et al.，2014）和西瓜種子（Yasmin et al.，2019）的活力。【本研究切入點】在種子活力檢測領域，因種子活力的基礎是種子成熟過程中貯藏物質的積累（Min and Kang，2008），而近紅外光譜區域與有機分子中含氫基團（OH、NH和CH）的振動組合頻率及各級倍頻吸收區域一致，故光譜信息可反映種子的組成信息，進而分析種子的活力狀態（Li et al.，2009）。通過前人研究（Jia et al.，2016；Pang et al.，2020）發現，NIRS具有評估玉米種子活力的潛力，然而大部分研究者采用的光譜采集模式并不相同，光譜采集模式對建模的影響也未見相關分析研究。本研究從光譜采集模式切入，比較2種采集模式下的預測模型，分析光譜采集模式對于建模效果的影響。【擬解決的關鍵問題】分別在反射和透射模式下采集甜玉米種子的NIRS，通過選取最佳預處理方法及變量選擇方法建立預測模型，從而比較2種采集模式下的預測模型差別，以確定哪種采集模式更適合甜玉米種子活力預測，為種子批量無損篩選提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Hai7和11F是廣東省農業科學院作物研究所育成的黃色超甜玉米（sh2）自交系，分別是高種子活力和低種子活力甜玉米的典型代表。以Hai7號為母本，與11F雜交，獲得雜種F1；F1與親本11F和Hai7連續回交3次，獲得2套BC3F1；經4代自交至穩定，最終獲得184個11F背景高代回交導入系（11F-ILs）和460個Hai7背景高代回交導入系（Hai7-ILs）。以11F-ILs和Hai7-ILs 2個群體的644份超甜玉米穩定自交系種子為試驗材料，成熟后收獲，曬干至含水量為13%，冷藏（溫度8℃，濕度50%）3個月，分別用于發芽試驗和種子活力指數的近紅外光譜無損檢測。主要儀器設備：Antaris II傅里葉變換近紅外光譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、Matlab（美國Mathworks公司）和PLS toolbox811（美國Eigen-vector Research公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 發芽率、發芽指數和活力指數測定按照GB/T 3543.4—1995《農作物種子檢驗規程 發芽試驗》，采用紙培法進行種子發芽試驗。第3 d測定發芽勢，3 d后將根取出，烘干，稱量干重，按照公式計算發芽勢、發芽指數和活力指數：

1.2.2 光譜采集所有樣品的光譜通過2種采樣模式得到：模塊A是積分球模塊，選取3粒甜玉米種子，記錄其在4000～10000 cm范圍內的積分譜；每個樣本掃描32次，分辨率為8 cm，平均光譜作為最終光譜。模塊B是透射模塊，取3粒甜玉米種子進行光譜采集，光譜范圍為6000～10000 cm，收集3個光譜，以平均光譜作為最終光譜。

1.2.3 模型建立與評價所有光譜數據均使用MATLAB 2016a進行處理。采用PCA和蒙特卡羅交叉驗證（Monte Carlo cross validation，MCCV）（Cao et al.，2010）方法剔除收集光譜中的異常點，然后用Kennard-Stone（K-S）方法（李華等，2011）將所有光譜按3∶2的比例分成校準組和驗證組。

采用偏最小二乘法（Partial least squared，PLS）建立預測模型。采用去趨勢（Detrend）、多元散射校正（Multiplicative scatter correction，MSC）、標準正態變換（Standard normal variate，SNV）和多項式平滑導 數（Savitzky-Golay derivative，SG）（Xia et al.，2020）選擇最佳預處理方法。為進一步提高模型的準確性，采用競爭自適應重加權抽樣（Competitive adaptive reweighted sampling，CARS）（Li et al.，2009）、非信息性變量剔除（Uninformative variables elimination，UVE）、隨機蛙跳法（Random frog，RF）和相關系數法（Correlation coefficients，CC）等不同的變量選擇方法（Song et al.，2017），從而篩選出最佳建模波段，建立用于種子活力預測的PLS定量模型（Li et al.，2018）。

在整個過程中，通過校正相關系數（）、交互驗證相關系數（）、預測相關系數（）、校正均方根誤差（RMSEC）、交互驗證均方根誤差（RMSECV）和預測均方根誤差（RMSEP）來評價所建立的模型性能。

2 結果與分析

2.1 漫反射模式結果

2.1.1 光譜離群點檢測部分光譜異常值的存在會影響預測模型的性能，降低其可信度，因此在光譜分析建模過程中，通常首先要剔除異常值，使得模型的性能更貼近實際，預測效果更佳。將PCA與MCCV相結合，識別潛在的異常值，結果如圖1所示。圖1-A中綠色虛線為95%的置信限，95%置信水平外的樣本被識別為離群值，綠色點為異常點，紅色點為正常樣品。利用MCCV進一步去除圖1-B所示的異常值。圖1-B中樣品分布較分散，平均值的分布范圍較大，因此將大于2倍的均值和標準偏差的樣品剔除。最后，共保存532份甜玉米種子樣品用于PLS建模研究。

2.1.2 漫反射光譜預處理方法的選擇圖2顯示532份甜玉米種子樣品的原始光譜，從原始近紅外光譜難以找到具體的波段，所有光譜均存在光散射引起的基線漂移。6897 cm附近的譜波數是高可溶性糖引起的主要吸收段，4283～4307 cm的譜波數表明可溶性糖和淀粉（Jiang et al.，2007）對C-H的拉伸和CH的結合吸收。據報道，這些成分與種子活力之間有很高的相關性（Cheng et al.，2018），然而更多的信息不明顯，表明預處理是必要的。

常用的光譜預處理方法包括均值中心化（Mean center，MC）、MSC、SNV、Detrend及SG。MC可增加樣品光譜之間的差異，提高模型的穩健性和預測能力；MSC可消除由于顆粒大小和分布不均勻造成的影響；SNV可消除固體顆粒大小與光程差異帶來的誤差影響；Detrend方法則可消除漫反射中的基線漂移；SG可有效去除背景基線等帶來的影響，提高光譜分辨率。不同預處理方法結合使用，一方面可彌補各自的不足之處，使得處理效果更佳，另一方面也可能存在過度平滑，導致光譜差異減弱，信號隱藏的問題。因此，選擇合適的預處理方法十分重要。

表1為對比不同預處理方法后建立的發芽勢偏最小二乘回歸（Partial least square regression，PLSR）模型結果，選出最佳的光譜預處理方法。從表中可看出，當光譜經MSC+MC預處理方法后得到的模型效果最佳，模型的性能參數、、RMSEC和RMSECV分別為0.722、0.578、11.711和13.818。

圖1 基于PCA（A）和MCCV方法（B）的樣本離群點檢測結果Fig.1 Sample outlier point detection based on PCA（A）and MCCV method（B）

圖2 通過漫反射模塊獲得532份種子樣品的原始近紅外光譜Fig.2 Raw NIR spectra of 532 seed samples by diffuse reflective module

表2為對比不同預處理方法后建立的發芽指數PLSR模型結果，選出最佳的光譜預處理方法，從表中可看出，當光譜經Detrend+MC預處理方法后得到的模型效果最佳，模型的性能參數、、RMSEC和RMSECV分別為0.810、0.668、2.225和2.825。

表3為對比不同預處理方法后建立的活力指數PLSR模型結果，選出最佳的光譜預處理方法，從表中可看出，當光譜經SG+MC預處理方法后得到的模型效果最佳，模型的性能參數、、RMSEC和RMSECV分別為0.791、0.693、0.148和0.175。

2.1.3 變量選擇方法的選擇為消除無關的變量信息、提高分析速度和減少模型的復雜程度，本研究對比不同的變量選擇方法，以RMSEC和RMSECV為主要評價指標，選出RMSEC和RMSECV最小的定量分析模型，從而確定最佳的變量組合。在最佳預處理基礎上，對比不同變量選擇方法對建模結果的影響，篩選出最佳的變量選擇方法。對于漫反射模塊發芽勢定量分析模型，最佳變量選擇方法為CARS，模型的性能參數、、RMSEC和RMSECV分別為0.836、0.763、9.293和10.941（表4）；對于漫反射模塊發芽指數定量分析模型，最佳變量選擇方法為CARS，模型的性能參數、、RMSEC和RMSECV分別為0.880、0.833、1.802和2.098（表5）；對于漫反射模塊活力指數定量分析模型，最佳變量選擇方法為CARS，模型的性能參數、、RMSEC和RMSECV分別為0.826、0.783、0.137和0.151（表6）。

表1 發芽勢PLSR模型不同預處理方法的結果Table 1 Results of different pretreatment methods under PLSR model of germination potential

表2 發芽指數PLSR模型不同預處理方法的結果Table 2 Results of different pretreatment methods under PLSR model of germination index

2.1.4 模型的建立與預測通過采用不同的預處理方法進行優化及采用波段選擇方法選出最佳的建模波段，然后建立PLS模型，用于對模型的預測能力進行檢驗。將驗證集的樣品帶入模型中，以和RMSEP為指標考察模型的預測能力。結果（圖3～圖5）表明，該模型存在一定程度的過擬合，因種子活力是一個復雜的指數，基于多種成分。因此，這個預測誤差（RMSEP=0.199）可以接受。反射率模型也會對預測能力產生一定的影響，因為只能得到種子的表面信息，可能是造成過擬合現象的原因。

2.2 透射模式結果

2.2.1 光譜離群點檢測光譜離群點檢測結果如圖6所示。圖6-A中藍色虛線為95%置信限，置信限里面為正常樣本，外面為異常樣本。圖6-B中樣品的分布較分散，平均值的分布范圍較大，因此將大于1.5倍的均值和標準偏差的樣品剔除，將剩余樣品用于下一步建模，最后選取415份樣品進行PLS建模研究。

2.2.2 透射光譜預處理方法的選擇圖7為415份甜玉米種子樣品的近紅外原始光譜。從圖中可看出，不同樣品光譜差異不明顯，光譜間相似性很高，所以需采取一些光譜預處理方法來提取光譜的有效信息，減少或除去物理因素、化學因素及儀器噪聲等對光譜的影響。

對不同預處理方法進行研究，結果如表7所示，SG一階導數平滑的預測能力最佳，RMSECV和分別為0.142和0.685，主成分數為9。

表3 活力指數PLSR模型不同預處理方法的結果Table 3 Results of different pretreatment methods under PLSR model of vigor index

表4 發芽勢PLSR模型不同變量選擇方法的結果Table 4 Results of different variable selection methods under PLSR model of germination potential

表5 發芽指數PLSR模型不同變量選擇方法的結果Table 5 Results of different variable selection methods under PLSR model of germination index

表6 活力指數PLSR模型不同變量選擇方法的結果Table 6 Results of different variable selection methods under PLSR model of vitality index

圖3 基于漫反射模型的發芽勢預測PLS模型Fig.3 Germination potential prediction based on diffuse reflective module under PLS model

圖4 基于漫反射模型的發芽指數預測PLS模型Fig.4 Germination index prediction based on diffuse reflective module under PLS model

圖5 基于漫反射模型的活力指數預測PLS模型Fig.5 Vigor index prediction based on diffuse reflective module under PLS model

圖6 基于PCA（A）和MCCV方法（B）的樣本離群點檢測果Fig.6 Sample outlier point detection based on PCA（A）and MCCV method（B）

2.2.3 變量選擇方法的選擇為消除無關的變量信息、提高分析速度和減少模型的復雜程度，本研究對比不同的變量選擇方法，以RMSEC和RMSECV為主要評價指標，結合主成分數，選出最佳的變量組合。對比不同變量選擇方法對建模結果的影響，發現對于透射活力指數定量分析模型，最佳變量選擇方法為CC，其性能參數、、RMSEC和RMSEP分別為0.783、0.680、0.121和0.133（表8）。

2.2.4 模型的建立與預測通過采用不同預處理方法進行優化及采用波段選擇方法選出最佳的建模波段，然后建立PLS模型，用于檢驗模型的預測能力。將驗證集的樣品帶入模型中，以和RMSEP為指標考察模型的預測能力。模型的性能參數、、、RMSEC、RMSECV和RMSEP分別為0.783、0.680、0.728、0.121、0.142和0.133（圖8）。

圖7 通過透射模塊獲得415份種子樣品的原始近紅外光譜Fig.7 Raw NIR spectra of 415 seed samples by transmission module

3 討論

探究甜玉米種子活力快速、準確、簡便、有效的檢測工具，可顯著提升高活力甜玉米新種質的能力和效率，NIRS分析技術作為一種快速分析技術在玉米質量快速分析方面有一定的研究。NIRS的采集模式主要有透射模式和漫反射模式2種。透射模式是光束透過樣品，通過分析透過光的差異來評價樣品信息的一種光譜采集模式；漫反射光譜則是通過分析樣品顆粒所反射的光或散射光的信息，從而評價樣品的一種光譜采集模式。李晉華等（2013）采用漫透射模式對玉米種子進行了成分預測；李武等（2018）采用漫反射模式對玉米種子活力進行了快速測定，并建立預測模型。本研究則從光譜采集模式入手，比較2種光譜采集模式下預測模型的差異，結果表明，透射模式相對于漫反射模式而言，甜玉米種子活力定量模型的性能參數更接近實際，不存在過擬合現象。分析原因可能是，采用透射模式采集光譜，由于光束穿過樣品，使得關于甜玉米種子的更多信息被捕獲到，反映在光譜上呈現出更復雜的現象，因此所建立的模型信息更全面，從而避免了過擬合現象。李晉華等（2013）采用漫透射方式成功地對玉米4種成分進行了預測，但其采用的樣品裝樣方式較復雜，且未對比漫反射模式的預測效果。李武等（2018）研究表明，NIR漫反射光譜可作為一種快速測定甜玉米種子活力形態指標實現種子篩選的快速方法，該研究利用FiPLS、CARS和UVE等變量篩選方法對甜玉米的NIRS進行特征波數區域選擇，篩選出甜玉米活性的特征區域，同時將便攜式微型光譜儀引入甜玉米活性的測定中，提出了一種新的甜玉米活性篩選方法，但研究中的樣品數量來源有限，隨著校正集樣品數量的增加，模型的精度和穩定性也會增加。本研究所采用的樣品數量也受到限制，因此模型的精度和穩定性仍不足。

表7 基于透射模塊的不同預處理方法的結果Table 7 Results of different pretreatment methods based on transmission module

表8 基于透射模塊的不同變量選擇方法的結果Table 8 Results of different variable selection methods based on transmission module

圖8 基于透射模塊的活力指數預測PLS模型Fig.8 Vigor index prediction based on transmission module under PLS model

NIRS技術可快速、準確、無損地檢測種子活力指數，顯示出種子篩選的巨大潛力，尤其在種子營銷和種子種植方面，對資源的安全保存，以及種子優化過程的快速篩選具有重要意義。然而，由于樣品的活力指數是用一批種子樣品的平均值來衡量，針對單個種子的研究尚不充分，因此今后需研究更多針對單個種子核的具體工作，且限于樣品種類，模型的應用性有待更深入的研究與優化。此外，為保證在實際生產中建立模型的準確性和適用性，在今后的研究中應盡可能地擴大玉米種子的來源、范圍和數量。

4 結論

本研究中，2種采集模式下的光譜經預處理和變量選擇后，建立得到最佳的甜玉米種子活力重要參數測定的定量分析模型。通過比較2種模式下的模型性能參數，結果發現透射模式下采集的光譜具有更多關于甜玉米種子活力的信息，更適用于甜玉米種子活力預測；同時提示NIRS技術在種子活力方面的研究中應考慮不同采集模式下光譜信息的差異，從而針對不同的研究對象，確定最佳采集模式。