酶抑制法在蔬菜質量安全控制中的應用

田 野

（湘潭市農產品質量安全檢測管理站，湖南湘潭 411100）

蔬菜是與人們日常生活密不可分的常用農產品，蔬菜質量安全是政府和廣大人民群眾十分關注的一件事情，它不僅關系到廣大人民群眾的生命安全，而且關系到社會的穩定發展。蔬菜產品中農藥殘留已成為威脅百姓餐桌安全的“隱形殺手”，成為全社會關注的一個熱點[1]。因此，加強蔬菜產品農藥殘留檢測，有效防止不合格蔬菜進入市場，做好蔬菜產品“從農田到餐桌”的全程質量安全管控十分重要。

目前農藥殘留快速生化檢測技術，主要有酶抑制法[2]和酶聯免疫法[3]。酶聯免疫法集測定的高靈敏性和抗體反應的強特異性于一體，是檢測某些重要痕量生物活性物質的好方法，但開發該種方法需要投入較多的資金和花費較長的時間，不利于廣泛推廣使用；酶抑制法是根據有機磷或氨基甲酸酯類農藥的毒理特性，建立的一種快速檢測農藥殘留的方法，是一種簡便、靈敏、快捷、經濟的檢測方法。因此，該法得到了大力推廣和使用，已經成為我國蔬菜農藥殘留快速檢測的主流技術之一。

1 酶抑制法檢測的基本原理和特點

1.1 酶抑制法的基本原理

有機磷和氨基甲酸酯類農藥種類雖然繁多，但具有相同靶標作用的乙酰膽堿酯酶，都能抑制昆蟲中樞和周圍神經系統中的乙酰膽堿酯酶的活性。根據昆蟲毒理學反應共性這一原理，在一定條件下，有機磷和氨基甲酸酯類農藥對乙酰膽堿酯酶正常功能具有抑制作用，酶催化乙酰膽堿水解，其水解產物與顯色劑反應，產生黃色物質。通過蔬菜樣品提取液對乙酰膽堿酯酶抑制程度的測定，即可判斷蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留是否超標[4]。在酶反應中加入顯色劑和底物，觀察溶液顏色的變化，采用分光光度計測定溶液體系的吸光度，即可判定乙酰膽堿酯酶受到抑制的程度，從而判定蔬菜中農藥殘留量的情況。即乙酰膽堿酯酶有機磷或氨基甲酸酯類農藥和乙酰膽堿酯酶反應，則酶活性被抑制。

樣本提取液和乙酰膽堿酯酶：如果樣本提取液中含有有機磷或氨基甲酸酯類農藥，則酶活性被抑制；如果樣本提取液中不含有有機磷或氨基甲酸酯類農藥，則酶活性正常[5]。有機磷農藥與乙酰膽堿酯酶的反應可用下式表示：

EOH+AX→X-+H++EOA

1.2 酶抑制法的特點

酶抑制法是根據有機磷或氨基甲酸酯類農藥的毒理特性，建立的一種快速檢測農藥殘留的方法。該法檢測時間短，整個檢測過程最多20min左右，靈敏度較高，對操作人員的要求、成本消耗及后期維護的費用均較低，具有簡便、快捷、靈敏、經濟、檢測人員易于掌握等特點。

2 酶抑制法檢測蔬菜中農藥殘留的應用

2.1 檢測范圍

（1）蔬菜：葉果類、瓜果類、豆菜、根莖類、蔥蒜類、茄果類等，其中小白菜、空心菜等極易存在農藥殘留。

（2）有機磷類農藥：甲胺磷、對硫磷、敵敵畏等；氨基甲酸酯類農藥：涕滅威、西維因、異索威、抗蚜威等[6]。

2.2 檢測條件

室溫保持在25～30℃，室內濕度不能高于85%[7]。

2.3 酶抑制法檢測蔬菜中農藥殘留

2.3.1 主要儀器與試劑

WX-201型農藥殘留快速檢測儀；臺式恒溫培養箱；微型樣品混合器；電子天平；移液槍；Agilent 6890N型氣相色譜儀，配有火焰光度檢測器和自動進樣器；N-EVAPI 12型旋轉氮吹儀。

稀釋液：用磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀和適量蒸餾水溶解。酶液：用乙酰膽堿酯酶配制。顯色劑：二硫代雙對硝基苯甲酸。底物試劑：碘化硫代丁酰膽堿。

2.3.2 檢測方法

取一定量的蔬菜樣品，切碎，混合均勻。稱取2g蔬菜樣品（非葉菜類稱取4g），置于玻璃瓶中，加入緩沖液20mL，振蕩3min后，倒出提取液，并靜置3～5min。將小試管進行編號，用50μL移液槍移取酶液50μL，放入每個小試管中，在1號小試管中加入緩沖液3mL。在剩下的小試管中，用3mL移液槍移取樣品提取液上清液3mL依次加入其中，再用50μL移液槍移取顯色劑50μL依次加入小試管中，搖勻，置于38℃恒溫培養箱內放置30min。將小試管取出，用50μL移液槍移取底物50μL依次加入小試管中，混勻后，分別倒入1cm比色皿中，立即放入儀器的樣品器皿中，關閉樣品池蓋，按下儀器“開始樣品分析”鍵，自動完成檢測。對照測試，用1號小試管，其他步驟按照樣品測試，得出空白試驗。同時將蔬菜樣品檢測結果與氣相色譜法進行驗證[8]。

依據國家標準，抑制率≥70%，樣品中殘留有機磷或氨基甲酸酯類農藥，表明樣品不合格；抑制率＜70%，表明樣品合格。蔬菜農藥殘留抑制率為-10%～110%，超出該范圍則說明操作失誤，必須重新檢測[9]。

2.3.3 檢測試驗結果分析

對酶抑制法檢測蔬菜中農藥殘留不合格的樣品，采用氣相色譜法進行驗證試驗。酶抑制法檢測的不合格樣品的檢測結果與氣相色譜法驗證的檢測結果如表1所示，農藥濃度與抑制率關系的結果如表2所示。從表1可以看出，酶抑制法的檢測結果與氣相色譜法的檢測結果符合率在90%以上。從表2可以看出，農藥濃度與抑制率呈現正相關。

表1 酶抑制法檢測結果和氣相色譜法驗證結果

表2 農藥濃度與抑制率的關系

3 酶抑制法對蔬菜中農藥殘留檢測存在的不足

3.1 檢測農藥種類的有限性

酶抑制法檢測蔬菜中農藥的殘留，只有機磷農藥和氨基甲酸酯類農藥可以檢測出，但有機氯類農藥、菊酯類農藥和殺蟲雙、噻螨酮、多殺菌素等其他類農藥則無法檢測出。酶抑制法對有機磷農藥和氨基甲酸酯類農藥雖然可以檢測出，但不能準確判斷超標農藥的品種和超標量[10]。

3.2 誤檢現象的發生

（1）蔬菜樣品色素的干擾對檢測結果準確性的影響。待測蔬菜樣品的色素如果含葉綠素、胡蘿卜素等較高時，則會影響透過率，使測得的透過率較低，影響對吸光度隨時間變化值的計算，使檢測結果的準確性大大降低。

（2）出現假陽性和假陰性現象。假陽性是由于酶活性降低或失活，底物不與酶反應，從而不能被水解，無法與顯色劑結合顯色；假陰性是由于某些農藥對酶抑制作用很小或無作用而產生的，表現出無農藥殘留的假象。另外在反應過程中，化學、物理干擾都可能導致假陽性、假陰性現象的發生。對蔬菜中農藥殘留檢測出現的假陽性和假陰性現象，都會影響檢測結果的準確性，出現誤檢現象[11]。

（3）空白值偏低。酶抑制法對蔬菜中農藥殘留的檢測過程中，比色時記載的空白3min前后吸光值差值在0.3～0.8為好。如果酶活性不夠，溫度太低，空白吸光值差值可能會偏低，低于0.3。

3.3 實際操作中易出現誤判現象

國內對于蔬菜農藥殘留的檢測，蔬菜樣品前處理環節比較簡單，主要按照國家標準《蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留量快速檢測》。實際操作時，蔬菜樣品提取液只在緩沖液中經過簡單的振蕩、混勻、靜置，沒有經過凈化和富集過程，干擾物質去除非常困難，因此，實際操作中容易出現誤判現象。

4 檢測過程中需注意的事項

1）檢測試劑必須保存在0～5℃低溫中，檢測前必須恢復至常溫，溫度過高或過低，都會使酶的活性受影響。配好的檢測試劑存放時間不宜過長，最長不超過30d。

2）靜置時間過長或過短都會對檢測結果有影響，因此，靜置時間最佳為10min。

3）測定體系的pH對乙酰膽堿酯酶的活性影響很大，因此，測定體系的pH最佳為7.5～8.0。

4）酶顯色最佳溫度為37～38℃，溫度低于37℃時，酶反應的速度減小，酶液和顯色劑反應的時間需相對延長，反應時間得延長，需根據乙酰膽堿酯酶空白對照測試3min，吸光度變化△A0值在0.2～1.0，才可繼續往下操作。應當特別注意，樣品溶液的放置時間必須與空白對照溶液的放置時間保持一致[12]，否則會影響檢測結果。

5 結論

1）對酶抑制法檢測蔬菜中農藥殘留不合格的樣品，采用氣相色譜法進行驗證試驗，將酶抑制法的檢測結果與氣相色譜法驗證的檢測結果進行分析比較，結果表明，酶抑制法檢測的結果與氣相色譜法檢測的結果符合率達到95%，農藥濃度與抑制率呈現正相關。

2）酶抑制法對蔬菜中農藥殘留的檢測很有效用，該技術是現階段控制高毒性、高殘留農藥，防止不合格蔬菜進入市場的一種十分有效的檢測方法，具有簡便、快捷、靈敏、經濟、檢測人員易于掌握等特點，在整個農產品質量安全體系中發揮著重要作用，現已得到廣泛普及。