含有席夫堿配體的釕配合物的合成、表征及抗腫瘤活性

賈士芳 郝秀麗 溫艷珍 張 燕

(太原科技大學化學與生物工程學院，太原030021)

隨著順鉑類配合物作為抗腫瘤藥物的發現及臨床應用[1]，金屬配合物作為抗腫瘤藥物的研究成為了一個熱門課題。金屬釕配合物是繼鉑類配合物后被認為最具有潛力的低毒高效的抗腫瘤藥物[2-7]。目前部分金屬釕配合物已被證實對某一種腫瘤細胞有效甚至進入臨床研究階段。1987年，Keppler等合成了對結腸癌有明顯效果的[HL][trans-RuバL2Cl4](其中L為含氮雜環配體)配合物[8]。1998年，第一個進入臨床研究的對轉移瘤有明顯抑制作用的NAMI型釕配合物由Alessio[9]合成并已進入臨床二期研究。2008年，德國的Schatzschneider[10]報道合成的金屬釕配合物[Ru(bpy)2(dppn)]2+通過插入模式與DNA結合后，具有與傳統順鉑類藥物對人乳腺癌及結腸癌細胞相近的半抑制率。2009年，Keppler等發現已經進入臨床一期的釕配合物KP1019[11]對Lewis肺癌和原發性直腸癌有明顯作用。

隨著合成技術的發展，不斷涌現出各種新型席夫堿類化合物。席夫堿類化合物可以應用到生物分析技術、金屬有機配體、熒光探針[12-13]、抗腫瘤[14-19]等方面。我們以4，4′-二(4-氨基苯氧基)聯苯、2，2′-二(4-氨基苯氧基)苯基丙烷、4，4′-二(4-氨基苯氧基)二苯砜為原料，分別與2-吡啶甲醛反應生成對應的席夫堿配體。原料都具有對稱結構，生成的配體都是對稱的雙齒配體，配體與二氯二聯吡啶釕以1∶2反應，生成了對應的雙核金屬釕配合物。

圖1 含有不同橋基團的席夫堿的三種雙核金屬釕配合物結構圖Fig.1 Structure of three dinuclear metal ruthenium complexes of Schiff bases with different bridging groups

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

三水合三氯化釕、2，2′-聯吡啶(bpy)、4，4′-二(4-氨基苯氧基)聯苯、2，2′-二(4-氨基苯氧基)苯基丙烷、4，4′-二(4-氨基苯氧基)二苯砜、2-吡啶甲醛、氘代三氯甲烷、氘代二甲基亞砜等均為市售分析純試劑，購于武漢申試化工有限公司。所有試劑都未經純化直接使用，使用的水為蒸餾水。胎牛血清購自美國Gibco公司。

主要儀器有AL204分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、DF-101B恒溫磁力攪拌器(鄭州長城科工貿有限公司)、SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)、PE20005型元素分析譜儀(美國PE公司)、Varian Mercury VX-300型核磁 共振儀(瑞士Bruker公司)、Nicolet38型傅里葉紅外光譜儀(Thermo Electron Corporation)、TU-1901型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)、Trace MS 2000GC/MS ESI質譜儀(德國NETZSCH公司)、Shimadzu RF-5301 PC熒光分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)、CHI630E電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)、EPICS XL-MCL型酶標儀(美國Beckman Coulter公司)、Varioskan Flash型多功能酶標儀(美國Thermo Scientific公司)。

1.2 目標配合物的合成

1.2.1 合成路線圖

配體及對應配合物的具體合成路線如圖2所示。

圖2 席夫堿配體BL1～BL3及對應的配合物Ru1～Ru3的合成路線Fig.2 Synthesis of Schiff base ligands BL1-BL3 and complexes Ru1-Ru3

1.2.2 配體及配合物的合成

配體BL1的合成：稱取0.37 g(1 mmol)4，4′-二(4-氨基苯氧基)聯苯和0.54 g(5 mmol)2-吡啶甲醛放入100 mL的圓底燒瓶中，加入35 mL甲醇，加熱攪拌回流8 h，有黃色固體產生，過濾得到黃色固體，用甲醇和蒸餾水各洗3次，真空干燥，得到0.48 g配體BL1，產率為88%。元素分析(C36H26N4O2)計算值(%)：C，79.1；H，4.8；N，10.3。實驗值(%)：C，79.2；H，4.8；N，10.4。1H NMR(CDCl3)：δ8.80(2H，d，J=3.0 Hz，Py)，8.64(2H，s，CH)，8.19(2H，d，J=6.0 Hz，Py)，7.81(2H，t，J=9.0 Hz，Py)，7.54(4H，d，J=6.0 Hz，Ph)，7.37(2H，t，J=3.0 Hz，Py)，7.36(4H，d，J=6.0 Hz，Ph)，7.12(8H，d，J=3.0 Hz,Ph)。IR(cm-1)：3 060(νC—H),1 625,1 578，1 476，1 463，1 279(νC=C，νC=N，νC—N)，1 243，1 279(νPh—O)，833，777，739(δC—H)。

配體BL2的合成：稱取0.41 g(1 mmol)2，2′-二(4-氨基苯氧基)苯基丙烷和0.54 g(5 mmol)2-吡啶甲醛，加入35 mL甲醇，加熱回流4.5 h。反應結束后，用旋轉蒸發儀將溶液蒸至5 mL，然后加入15 mL石油醚，待溫度冷卻到0℃，有黃色固體析出。過濾，真空干燥得到BL2固體0.42 g，產率為72%。元素分析(C39H32N4O2)計算值(%)：C，79.6；H，5.5；N，9.5。實驗值：C，79.6；H，5.4；N，9.6。1H NMR(CDCl3)：δ8.80(2H，s，Py)，8.64(2H，s，CH)，8.19(2H，d，J=6.0 Hz，Py)，7.81(2H，t，J=9.0 Hz，Py)，7.54(4H，d，J=6.0 Hz，Ph)，7.37(2H，t，J=3.0 Hz，Py)，7.36(4H，d，J=6.0 Hz，Ph)，7.12(8H，d，J=3.0 Hz，Ph)，1.70(6H，s，CH3)。IR(cm-1)：3 060(νC—H)，1 625，1 578，1 476，1 463，1 279(νC=C，νC=N，νC—N)，1 243，1 279(νPh—O)，833，777，739(δC—H)。

配體BL3的合成：稱取0.44 g(1 mmol)4，4′-二(4-氨基苯氧基)二苯砜和0.54 g(5 mmol)2-吡啶甲醛，加入35 mL甲醇，加熱回流4.5 h，反應結束后，用旋轉蒸發儀將溶液蒸至5 mL，有黃色固體析出。過濾，真空干燥得到0.51 g固體BL3，產率為83%。元素分析(C36H26N4O4S)計算值(%)：C，70.8；H，4.3；N，9.2。實驗值(%)：C，70.7；H，4.3；N，9.3。1H NMR(CDCl3)：

δ8.64(2H，d，J=3.0 Hz，Py)，8.23(2H，s，CH)，7.98(2H，d，J=6.0 Hz，Py)，7.86(4H，d，J=6.0 Hz，Ph)，7.83(2H，t，J=9.0 Hz，Py)，7.41(4H，d，J=6.0 Hz，Ph)，7.36(8H，d，J=3.0 Hz，Ph)。IR(cm-1)：1 629，1 585，1 488，1 296(νC=C，νC=N，νC—N)，1 243(νPh—O)，833，777，742(δC—H)。

配合物Ru1的合成：稱取0.52 g(1 mmol)Ru(bpy)2Cl2·2H2O和0.34 g(2 mmol)AgNO3，放入250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL乙醇，磁力攪拌加熱回流2 h，趁熱過濾，除去AgCl沉淀，得到棕紅色濾液A。稱取0.27 g(0.5 mmol)配體BL1于250 mL三頸燒瓶中，將濾液A加入燒瓶中，反應液在N2保護下回流攪拌12h。停止反應，旋轉蒸發至有固體出現，以CH3CN/飽和KNO3水溶液(1∶1，V/V)的混合溶劑作為洗脫劑，在硅膠柱上分離，得到的黃色溶液通過旋轉蒸發除去大部分溶劑，然后加入過量的NaClO4的飽和乙醇溶液，沉淀出黃色固體，過濾，用熱的甲醇和水(10 mL)各洗3次，真空干燥，得到黃色固體0.63 g，產率72%。，元素分析(C76H58N12O18Cl4)計算值(%)：C，51.5；H，3.3；N，9.5。實驗值(%)：C，51.6；H，3.4；N，9.7。1H NMR(DMSO-d6)：δ8.89(2H，t，J=3.0 Hz，Py)，8.69(2H，d，J=6.0 Hz，Py)，8.64～8.67(2H，m，Py)，8.51(2H，t，J=6.0 Hz，bipy)，8.21～8.24(6H，m，bipy)，8.01(4H，t，J=9.0 Hz，Py)，7.86(2H，d，J=3.0 Hz，Py)，7.79(2H，s，CH)，7.72(12H，m，bipy)，7.50(4H，d，J=6.0 Hz，Ph)，7.38(4H，d，J=9.0 Hz，Ph)，6.80～7.00(4H，m，bipy)，6.69(4H，d，J=3.0 Hz，bipy)，6.64(4H，d，J=3.0 Hz，bipy)。IR(cm-1)：1 603，1 489(νC=C，νC=N)，1 240(νPh—O，νC—N)，768，625(δC—H)，1 106(νCl—O)。

配 合 物Ru2的 合 成：0.29 g(0.5 mmol)BL2和0.52 g(1 mmol)Ru(bpy)2Cl2·2H2O在乙醇溶液里回流12 h，硅膠柱分離，以乙腈/硝酸鉀的飽和溶液(1∶1，V/V)為洗脫劑，得到黃色產品0.65g，產率74%。元素分析(C79H64N12O18Cl4)計算值：C，52.3；H，3.5；N，9.3。實驗值(%)：C，52.4；H，3.9；N，9.1。1H NMR(DMSOd6)：δ8.89(2H，t，J=3.0 Hz，Py)，8.66(2H，d，J=6.0 Hz，Py)，8.62(2H，d，J=6.0 Hz，Py)，8.49(2H，d，J=6.0 Hz，bipy)，8.24～8.28(8H，m，bipy)，7.96～8.00(4H，m，Ph)，7.86(2H，s，CH)，7.79(2H，d，J=9.0 Hz，Py)，7.69(6H，m，bipy)，7.64(4H，m，bipy)，7.54(4H，d，J=6.0 Hz，Ph)，7.35(4H，d，J=3.0 Hz，Ph)，7.27(4H，d，J=9.0 Hz，Ph)，6.76(6H，d，J=3.0 Hz，bipy)，6.67～6.70(6H，m，bipy)，1.65(6H，s，CH3)。IR(cm-1)：1 625,1 578,1 476，1 463，1 279(νC=C，νC=N，νC—N)，1 243，1 279(νPh—O)，833，777，739(δC—H)，1 118(νCl—O)。

配 合 物Ru3的 合 成：0.30 g(0.5 mmol)BL3和0.52 g(1 mmol)Ru(bpy)2Cl2·2H2O在乙醇溶液里回流12 h，硅膠柱分離，以乙腈/硝酸鉀的飽和溶液(1∶1，V/V)為洗脫劑，用NaClO4的飽和乙醇溶液沉降，得到黃 色 產 品0.75 g，產 率82%。元 素 分 析(C76H58N12SO20Cl4)計算值(%)：C，49.7；H，3.2；N，9.2。實驗值(%)：C，49.7；H，3.2；N，9.2。1H NMR(DMSOd6)：δ8.87(2H，t，J=3.0 Hz，Py)，8.67(2H，d，J=6.0 Hz，Py)，8.62(2H，d，J=6.0 Hz，Py)，8.50(4H，t，J=9.0 Hz，bipy)，8.22～8.29(8H，m，bipy)，8.01(4H，d，J=6.0 Hz，Ph)，7.96～7.99(4H，m，bipy)，7.86(2H，d，J=9.0 Hz，Py)，7.79(2H，d，J=3.0 Hz，CH)，7.72(4H，d，J=9.0 Hz，bipy)，7.68(4H，d，J=6.0 Hz，Ph),7.64(4H，d，J=6.0 Hz，Ph)，7.53(4H，d，J=3.0 Hz，Ph)，7.35(2H，t，J=9.0 Hz，bipy)，6.90(2H,d，J=6.0 Hz,bipy),6.84(4H,d，J=9.0 Hz，bipy)，6.69(4H，d，J=3.0 Hz，bipy)。IR(cm-1)：1 603，1 583，1 487，1 465，1 294(νC=C，νC=N，νC—N)，1 244(νPh—O)，1 108(νCl—O)，768，626，558(δC—H)。

1.3 生物活性檢測

按照標準的MTT測試方法進行活性檢測[20-21]，分為4步：(1)種入細胞。在96孔板的第3～11列用排槍分別加入懸有細胞的200 μL培養基，第2列作為溶劑空白，96孔板周圍加培養基防止揮發，使每孔細胞數大約為1×104個，將96孔板放入37℃、CO2體積分數5%的培養箱中過夜，觀察細胞生長情況，待80%細胞貼壁后，進行下一步。(2)加藥。在24孔板的10個孔中各加入3 mL培養基，將所加藥物稀釋到不同濃度梯度，用排槍將孔中原有的培養液吸掉，每一列加入相同濃度的藥物，加完后，放入培養箱培養48 h。(3)加MTT。在藥物與細胞相互作用結束前4 h，吸去培養液，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2次，然后每孔加入180 μL PBS，再加入20 μL 5 mg·mL-1的MTT，放入培養箱繼續培養4 h。(4)加DMSO。4 h后拿出96孔板，吸掉上清液，每孔加入150 μL DMSO，放入搖床內搖10 min，將紫色結晶物充分溶解，放入酶標儀卡槽內，在490 nm波長處掃描，得到光密度(OD)，OD可以間接地反映活細胞的數量(式1)，以此來求出半數抑制濃度IC50。

R=ODexp/ODcontrol×100% (1)

其中，R表示細胞存活率(即細胞活力)，ODexp表示實驗組OD，ODcontrol表示對照組OD。

2 結果與討論

2.1 配體的合成

通過2-吡啶甲醛和對應的二元胺以2∶1的物質的量之比在甲醇中加熱回流，可以得到黃色固體，用熱的甲醇洗滌3次，得到黃色產品。元素分析得到的測試值與計算值基本符合，3個配體的紅外光譜圖中在1 625 cm-1處均有吸收帶，說明配體中有C=N鍵 存 在，以CDCl3為 溶 劑，對BL1～BL3進 行了1H NMR表征。BL1的1H NMR譜圖中有8組峰(圖S1，Supporting information)，苯 環 上Ha和Hb的δ=7.12，是雙重峰；另一個苯環上Hc和Hd的δ為7.36和7.54，是2組雙重峰；—CH=N氫的δ=8.64，是一個單峰；吡啶 環 上氫的δ分別為7.37、7.81、8.19和8.80，Hg和Hh是三重峰，Hf和Hi是雙重峰。由于py-CH=N是一個吸電子基團，Hc和Hd離py-CH=N近，所以Hc和Hd的化學位移與Ha和Hb相比向低場移動。BL2和BL3的1H NMR譜圖與BL1相似。

2.2 配合物的合成

配合物Ru1～Ru3分別通過Ru(bpy)2Cl2·2H2O和相應的配體BL1、BL2和BL3以2∶1的物質的量之比反應，用NaClO4飽和溶液沉降出產物，元素分析結果表明，所生成的配合物是雙核配合物。配合物Ru1～Ru3的1H NMR在DMSO-d6中測 定，配 合 物Ru3的1H NMR譜圖如圖3所示。金屬配合物的圖譜相比配體較復雜，一是因為芳香環上氫的電子云密度相近，以至于它們的化學位移接近，芳香環區域光譜比較復雜，很難指認是哪個氫的化學位移；另一方面，因為金屬離子與配體反應時生成一對對映體，所以配合物的核磁圖譜比較復雜。但是，3個配合物在δ=9.0處都有一個明顯的單峰，這個峰對應CH=N上氫的化學位移。

圖3 配合物Ru3在DMSO-d6中的1H NMR譜圖Fig.3 1H NMR spectrum of complex Ru3 in DMSO-d6

為了進一步確認配合物的結構，以CH3CNCH3OH為溶劑，測定了配合物的電噴霧質譜。電噴霧質譜對于證明分子量比較大的過渡金屬配合物的分子量是非常可靠的。3個配合物的MS譜圖中都只有一個強的離子峰，它們的m/z值分別為343.6([Ru(BL2)(bpy)2]24+)、354.2([Ru(BL1)(bpy)2]24+)和359.3([Ru(BL3)(bpy)2]24+),與計算值相符(圖S2)。這一結果表明雙核釕配合物在溶液中是穩定的。

2.3 配合物的電化學性質

采用微分脈沖伏安法(differential pulse voltammetry，DPV)來測定配合物的氧化還原電位，將配合物溶解在乙腈里，進行DPV測試，數據列于表1中。3個配合物在0～1.5 V范圍內均有2個氧化還原峰，而在外界條件相同的情況下測定配體的氧化還原電位，發現配體在0～1.5 V內沒有明顯的峰，所以這些峰為金屬中心的氧化-還原峰。從圖4可以看出，Ru3的2個氧化還原峰分別在0.90和1.28 V，分別對應于[Ru(BL3)(bpy)2]25+/[Ru(BL3)(bpy)2]24+和[Ru(BL3)(bpy)2]26+/[Ru(BL3)(bpy)2]25+電對，2個半波電位的差值為380 mV。

表1 Ru1～Ru3的光譜學、電化學數據及脂水分配系數(lg P)Table 1 Spectroscopic,electrochemistry data and fat-water partition coefficient(lg P)of Ru1-Ru3

圖4 配合物Ru3在CH3CN中的DPV圖Fig.4 DPV diagram of complex Ru3 in CH3CN

2.4 配合物的光譜性質

將3個配合物分別配制成10 μmol·L-1的乙腈溶液，測定其UV-Vis光譜，所得譜圖如圖5a所示。表1列出了3個配合物Ru1、Ru2和Ru3的最大吸收波長。3個配合物的UV-Vis光譜相似，均有3個吸收峰，各個配合物對應的最大吸收峰波長值非常接近，分別在290、360和490 nm附近。每個吸收峰都可以找到相應歸屬：290 nm對應為一個又窄又強的吸收帶，歸屬為未帶任何取代基的聯吡啶的π-π*電子躍遷產生的吸收；360 nm對應于電子從金屬躍遷到配體的單重態吸收，即為1MLCT吸收；490 nm對應的較寬譜帶歸屬為電子從金屬躍遷到配體的三重態吸收，即為3MLCT吸收。

圖5 配合物Ru1～Ru3在CH3CN中的(a)UV-Vis和(b)熒光光譜圖Fig.5(a)UV-Vis and(b)fluorescence spectra of complexes Ru1-Ru3 in CH3CN

將配合物溶解在乙腈中，配成濃度為10 μmol·L-1的溶液，對配合物進行熒光光譜測試，以450 nm作為激發波長，掃描發射光譜，結果如圖5b所示。3個配合物的發射波長均在600 nm左右，配體沒有熒光，說明該系列配合物的熒光是金屬釕發射出來的。

2.5 生物活性檢測

以人宮頸癌細胞Hela、胃癌細胞BGC823、胃癌細胞SGC-7901和人正常胚肺成纖維細胞MRC-5為對象，通過MTT法檢測了3個配合物對腫瘤細胞的細胞毒性。配合物對各細胞作用48 h后能夠看到較明顯的腫瘤細胞死亡變化。圖6顯示了配合物Ru1～Ru3對Hela、BGC823、SGC-7901和MRC-5的細胞毒性結果。

圖6 配合物Ru1～Ru3對Hela、BGC823、SGC-7901和MRC-5的細胞毒性Fig.6 Cytotoxicity of complexes Ru1-Ru3 on Hela,BGC823,SGC-7901,and MRC-5

從表2可以看出，3個配合物對3種腫瘤細胞的毒性大小排序均為Ru3＞Ru1＞Ru2，可能的原因是配合物Ru3含有亞砜結構，配合物疏水性強，親脂性大，溶解度低，使得配合物容易累積到線粒體內[22]。還可以看到，該系列配合物對BGC823的毒性均為最強。而3個配合物對MRC-5的IC50都大于100 μmol·L-1，說明 配合 物對 正常 細胞 沒有 細胞毒性。

2.6 配合物的脂水分配系數

抗癌藥物的活性通常與它們的親脂性有關，由此產生的疏水性可能有助于增加細胞對藥物的攝取，從而增強其抗癌活性[23-27]。我們測試了Ru1～Ru3的標準辛醇-水分配系數(lgP)，結果見表2。lgP的大小順序與上面得到的配合物的細胞毒性強弱呈一致關系，也間接地證明了我們的推測有一定的道理。這一結果初步表明釕配合物的抗癌活性與lgP有直接關系，其抗癌活性隨配合物親脂性的增加而增強。

2.7 活性氧檢測

通過MTT實驗得出的結論是配合物對腫瘤細胞有毒性而對正常細胞沒有毒性，為了證實這一點我們做了活性氧(ROS)檢測實驗。ROS是生物體代謝過程中產生的含氧自由基或者容易形成自由基的過氧化物的總稱。腫瘤細胞內ROS水平要高于正常細胞，這使得抗氧化酶對ROS的耐受性達到了極限，如果ROS再升高則會導致腫瘤細胞的凋亡[28]，即使ROS水平下降也對腫瘤細胞的增值造成負面影響。

將 配 合 物Ru1～Ru3分 別 作 用 于BGC823和MRC-5，每個配合物設置2個濃度(6.25和12.5 μmol·L-1)。培養24 h后用DCFH-DA作為熒光探針檢測細胞內ROS的變化(圖7)。結果發現配合物Ru1～Ru3能增加腫瘤細胞內ROS的水平，并且配合物濃度越高，增強作用越明顯。配合物的作用強度為Ru3＞Ru1＞Ru2，與MTT實驗結果一致。但是，配合物Ru1～Ru3對正常細胞內ROS的水平并沒有明顯的影響。

圖7 配合物Ru1～Ru3對BGC823(a)和MRC-5(b)內ROS水平的影響Fig.7 Effect of complexes Ru1-Ru3 on ROS level in(a)BGC823 and(b)MRC-5

3 結論

以4，4′-二(4-氨基苯氧基)聯苯、2，2′-二(4-氨基苯氧基)苯基丙烷、4，4′-二(4-氨基苯氧基)二苯砜和2-吡啶甲醛為原料，合成了3個雙齒配體，并在此基礎上合成了3個雙核釕配合物Ru1～Ru3。通過元素分析、核磁共振氫譜、紅外光譜、電噴霧質譜對配體及配合物進行了結構表征，證實了配合物結構的正確性。此外，通過MTT法測試了Ru1～Ru3對Hela、BGC823、SGC-7901和MRC-5四種細胞的毒性，結果顯示Ru3的抗腫瘤活性強于Ru1和Ru2，而在所測的3種腫瘤細胞中，Ru1～Ru3均表現出對BGC823有很好的選擇性(Ru3毒性最強)，說明Ru3可能成為治療癌癥的潛在藥物。

Supporting information is available at http：//www.wjhxxb.cn