淡豆豉前酵過程中蛋白酶纖維素酶脂肪酶變化規律△

王奕博，鐘榮榮，范亞楠，周旭，孫曉叢，陳彥琳，杜杰

中國中藥有限公司，北京 102600

淡豆豉又名豉、淡豉、香豉、大豆豉等，是豆科植物大豆成熟種子的發酵加工品，具有解表、除煩、宣發郁熱之功，常用于治療感冒、寒熱頭痛、煩躁胸悶、虛煩不眠等[1]。現代研究表明，淡豆豉具有抗腫瘤、抗骨質疏松、降血糖、調血脂等功效，其有效成分包括大豆苷元、γ-氨基丁酸、大豆低聚糖等[2-4]。淡豆豉的生產方式多為天然發酵，參與發酵的菌種包括枯草芽孢桿菌、米曲霉、酵母菌等[5]，其分泌的蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等可有效分解大豆中蛋白質、脂肪油、纖維素等，進而產生淡豆豉的藥效和特有風味。淡豆豉發酵過程一般分為前酵和后酵（再悶）2 個部分，其中前酵多為常溫有氧發酵，傳統認為發酵至“黃衣上遍”即可，一般需要4～5 d，后酵則多為高溫無氧發酵。目前，研究多以黃酮苷元、γ-氨基丁酸含量等為指標對淡豆豉進行質量控制[6-7]，對淡豆豉前酵過程關注較少，而淡豆豉前酵產物的優劣直接關系到后酵成品的質量。本研究擬對淡豆豉前酵過程中蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶活力，質量損失率、黃酮苷類成分變化進行動態分析，闡明前酵過程中淡豆豉相關酶活力的變化，為控制淡豆豉前酵質量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695-empower型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；UV2600型紫外-可見分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司）；Centrisart?A-14C 型微量離心機（德國賽多利斯公司）；XS205 型電子分析天平（梅特勒-托利多公司）；HH-4 型數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；HY-2 型往復振蕩器（常州澳華儀器有限公司）；T18 Digital 數顯型分散機（IKA公司）。

1.2 試藥

中性蛋白酶活性檢測試劑盒（批號：20201104）、酸性蛋白酶活性檢測試劑盒（批號：20201104）、堿性蛋白酶活性檢測試劑盒（批號：20201104）均購自北京索萊寶科技有限公司；橄欖油（批號：20201204）、乳酸鹽緩沖液（pH=3.0，批號：L05D11G133477）、磷酸鹽緩沖液（pH=7.5，批號：L03F12G139378）、硼酸鹽緩沖液（pH=10.5，批號：L01N11G129662）均購自上海源葉生物科技有限公司；氫氧化鉀容量分析用溶液（0.050 09 mol·L-1，批號：S4X1）、鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液（pH=4.01，批號：L5X1）均購自北京海岸鴻蒙標準物質技術有限責任公司；聚乙烯醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：30153160）；甲醇（賽默飛世爾科技有限公司，色譜純）；其余試劑均為分析純。

參考《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版自制淡豆豉前酵樣品，發酵溫度為26 ℃，相對濕度為75%，發酵至第5 天時外觀呈“黃衣上遍”，到達發酵終點。分別在前酵第1、2、3、4、5天取樣，45 ℃干燥，即得實驗用樣品。

2 方法與結果

檢測不同前酵時間（1、2、3、4、5 d）淡豆豉中3 種蛋白酶及纖維素酶、脂肪酶活性，黃酮類成分含量變化和質量損失率，每個時間節點平行制備2批樣品，每個樣品平行檢測3次。數學統計均使用SAS 8.2軟件。

2.1 酸性、中性、堿性蛋白酶活力測定方法

以中性蛋白酶為代表，建立3 種蛋白酶活力測定方法學。

2.1.1粗酶液的制備 淡豆豉粉碎，過三號篩，取粉末0.5 g，置于50 mL離心管中，加入緩沖液25 mL，搖勻，振蕩10 min，取混懸液2 mL，12 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為4.5 cm），取上清液，即得。其中，乳酸鹽緩沖液提供酸性環境，磷酸鹽緩沖液提供中性環境，硼酸鹽緩沖液提供堿性環境。

2.1.2酶活力測定方法 參照試劑盒說明書及《中華人民共和國國家標準：蛋白酶制劑》（GB/T 23527—2009）[8]確定方法：對照管中加粗酶液100μL，三氯醋酸溶液200μL，測定管中加粗酶液100μL，對應pH的酪蛋白緩沖鹽溶液200μL，混勻，30 ℃水浴10 min后，對照管加入對應pH的酪蛋白緩沖鹽溶液200μL，測定管加入三氯醋酸溶液200μL，混勻，12 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為4.5 cm），取上清液。測定管、對照管加對應上清液各200μL，空白管加蒸餾水200 μL，標準管加0.25 μmol·mL-1酪氨酸溶液200μL，4 種離心管中再均加入碳酸氫鈉溶液1 mL、福林-酚試劑200 μL，混勻，30 ℃水浴20 min，于680 nm測定吸光度（A）。

按公式（3）計算蛋白酶活力。每克樣本每分鐘催化水解產生1μmoL酪氨酸為1個酶活單位。

式中C標準品為標準品濃度（μmol·mL-1），W為樣本質量（g），V1為酶促反應總體積（mL），V2為加入反應體系中粗酶液體積（mL），V3為粗酶液總體積（mL），T為催化反應時間（min）。

2.1.3標準曲線的制備 取離心管，分別加入蒸餾 水，0.125、0.167、0.200、0.250、0.333、0.500 μmol·mL-1酪氨酸溶液各200μL，按2.1.2 項下方法進行測定，以A為橫坐標，酪氨酸物質的量為縱坐標，繪制標準曲線：Y=0.104 0X+0.004 2（r=0.999 3），0.02～0.10μmol呈良好的線性關系。

2.1.4精密度試驗 取2.1.3項下0.250μmoL·mL-1標準品連續測定6 次，RSD 為0.142%，說明方法精密度良好。

2.1.5重復性試驗 按2.1.1 項下方法制備6 批粗酶液，按2.1.2 項下方法制備樣品并檢測，酶活力的RSD為3.530%，說明方法重復性較好。

2.1.6穩定性試驗 按2.1.1 項下方法制備粗酶液，按2.1.2 項下方法制備樣品，分別在0、10、20、30、60、120、180 min 檢 測，A的RSD 為4.468%。實驗發現，隨著待測樣品放置時間增加，A不斷上升，180 min 后檢測得到的A值較最初增加0.44，故認為樣品應水浴立刻檢測。

2.2 纖維素酶活力測定方法

2.2.1粗酶液的制備 淡豆豉粉碎，過三號篩，取粉末2.0 g，置于50 mL離心管中，加入鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液25 mL，搖勻，振蕩10 min，取混懸液2 mL，12 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為4.5 cm），取上清液，即得。

2.2.2酶活力測定方法 參照試劑盒說明書所載方法：對照管中加煮沸的粗酶液100μL，測定管中加粗酶液100μL，各加入羧甲基纖維素鈉溶液50μL、鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液200 μL，混勻，50 ℃水浴30 min，取出后立即放入沸水中煮沸15 min，得糖化液。對照管、測定管中加入相應的糖化液100μL，各加入3，5-二硝基水楊酸（DNS）溶液150μL，混勻，沸水浴中煮沸，顯色15 min，冷卻，加入蒸餾水1000μL，混勻，540 nm處蒸餾水調零，測定A。根據標準曲線計算樣本葡萄糖濃度，每克組織在反應體系中每分鐘催化產生1μg葡萄糖定義為1個酶活力單位。

按公式（4）計算纖維素酶活力。

式中1000 為單位換算系數，y為樣本質量濃度（mg·mL-1），V反總為反應體系總體積（mL），V樣為加入樣本體積（mL），V樣總為加入提取液體積（mL），T為反應時間（min），W為樣本質量（g）。

2.2.3標準曲線的制備 取離心管，分別加入蒸餾水，0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1葡萄糖溶液各50 μL，按2.2.2 項下方法進行測定，以A為橫坐標（X），質量濃度為縱坐標（Y），繪制標準曲線：Y=1.033 9X+0.028 0（r=0.999 7），0.1～1.0 mg·mL-1呈良好的線性關系。

2.2.4精密度試驗 取質量濃度為0.45 mg·mL-1標準品連續測定6 次，A的RSD 為0.198%，說明方法精密度良好。

2.2.5重復性試驗 按2.2.1 項下方法制備6 批粗酶液，按2.2.2 項方法制備樣品并檢測，酶活力RSD為2.914%，說明方法重復性較好。

2.2.6穩定性試驗 取2.2.4 項下標準品，分別在0、10、20、30、40、50、60 min 檢測，A的RSD 為0.486%，說明樣品在60 min內穩定性良好。

2.3 脂肪酶活力測定方法

參照《中華人民共和國國家標準：脂肪酶制劑》（GB/T 23535—2009）[9]進行檢測，粗酶液制備方法：淡豆豉粉碎，過三號篩，取粉末2.0 g，置于50 mL離心管中，加入磷酸鹽緩沖液25 mL，搖勻，振蕩10 min，取混懸液2 mL，12 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為4.5 cm），取上清液，即得。加酶量為2 mL。

2.4 前酵過程質量損失率測定方法

取蒸熟的黑豆300 g，共10 份，分別進行前酵，每天取出2 份，35 ℃干燥，計算質量損失，前酵共5 d。

2.5 前酵過程中黃酮類成分測定方法

使用參考文獻[10]中的檢測方法。大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素的線性范圍分別為1.44～72.00、0.410 4～20.520 0、2.88～144.00、1.272～63.600、0.206 6～10.330 0、1.314～65.700 μg·mL-1，加樣回收率分別為107.59%、101.17%、99.70%、101.60%、96.08%、101.99%，RSD均小于2%。

2.6 前酵過程中3種蛋白酶活力變化趨勢

前酵過程中3種蛋白酶活力變化見圖1～2。

圖1 淡豆豉前酵過程中3種蛋白酶活力變化（, n=2）

由圖1～2可知，酸性蛋白酶活力在前酵第2天即達到最高，但仍遠小于其他2 種蛋白酶，后續趨近消失；堿性蛋白酶活力呈先快速增加后平穩的趨勢，在前酵4 d 內活力高于其他2 種酶；中性蛋白酶呈穩定增加的趨勢，在前酵第5 天時活力超過堿性蛋白酶。

2.7 前酵過程中纖維素酶活力變化趨勢

由圖3 可知，纖維素酶活力在前酵過程中總體呈升高趨勢，僅前酵第3 天時有略微下降，和中性蛋白酶結果趨勢接近。同時考慮到纖維素酶耐高溫，在后酵過程中也可發揮作用，且其可將黃酮類成分有效轉化為黃酮苷元，故認為纖維素酶可以作為淡豆豉前酵過程的一個控制指標。

2.8 前酵過程中脂肪酶活力變化趨勢

前酵過程中脂肪酶活力先增加后略微下降，前酵第4天時酶活力達到頂峰（圖4）。

圖4 淡豆豉前酵過程中脂肪酶活力變化（, n=2）

2.9 前酵過程淡豆豉質量損失率變化趨勢

隨著前酵時間的增加，淡豆豉質量損失率逐漸升高（圖5），說明在微生物作用下，淡豆豉營養成分在被不斷分解消耗。

圖5 淡豆豉前酵過程質量損失率變化

2.10 前酵過程黃酮類成分變化趨勢

前酵過程黃酮類成分變化見圖6，其含量已扣除質量損失。

圖6 淡豆豉前酵過程中黃酮類成分質量分數變化（, n=2）

《中國藥典》2020 年版以大豆素和染料木素作為淡豆豉質量控制指標，規定其總質量分數不得少于0.04%[1]。由圖6 可知，在前酵過程中，黃酮苷類成分不斷轉化為苷元。以大豆苷為例研究前酵過程中黃酮類成分轉化損失，大豆苷相對分子質量為416.38，大豆素相對分子質量為254.23。由圖6可知，前酵過程中大豆苷的質量分數降低了0.83 mg·g-1，大豆素質量分數應增加0.507 mg·g-1，但實際增加量僅為0.26 mg·g-1，說明前酵過程中微生物會破壞黃酮類成分，提示前酵過程中適度發酵可保留淡豆豉指標成分。

使用SAS 8.2 軟件對淡豆豉發酵過程中質量損失率，黃酮苷類成分、黃酮苷元類成分與3 種酶活力的變化進行分析，發現6 組數據均正態，故計算其Pearson 相關系數（r），對相關性顯著的數據進行回歸分析，計算其直線相關的調整決定系數（R2adj），結果見表1。

表1 前酵過程中其他指標和3種酶活力相關性

可以發現，中性蛋白酶和前酵過程中質量損失、黃酮苷類成分損失相關性強（∣r∣＞0.98），纖維素酶、脂肪酶與其相關性較弱，提示中性蛋白酶可作為前酵過程中的1 個控制指標，其代表了微生物對淡豆豉的分解作用，在生產中可以通過檢測中性蛋白酶活力側面表征發酵程度，以便更好地量化“黃衣上遍”這一傳統前酵終點指標。對于黃酮苷元類成分增加量，脂肪酶與其相關性較強，但R2adj仍較低，其原因可能與微生物對黃酮苷的分解有關。

3 討論與結論

黑曲霉、米曲霉、擔子菌和酵母菌等可分泌酸性蛋白酶，米曲霉和芽孢桿菌屬微生物可分泌中性蛋白酶，芽孢桿菌屬和鏈霉菌屬微生物，可分泌堿性蛋白酶[11]。因此，蛋白酶活力可側面反映相關菌種的生長情況。從圖2 可以發現，酸性蛋白酶活力增長速率前酵2 d后即開始負增長，說明可能此時黑曲霉、酵母菌等生長受到抑制；堿性蛋白酶活力增長速率在前酵第2 天達到頂峰后逐漸降低，說明可能此時枯草芽孢桿菌大量繁殖，也解釋了為何淡豆豉前酵過程2～3 d時曲塊較黏，翻曲可拉絲；中性蛋白酶活力增長速率始終較為穩定，說明米曲霉等中性蛋白酶相關菌在前酵過程中穩定增長，也符合傳統前酵終點“黃衣上遍”，即米曲霉大量繁殖并產生孢子。纖維素酶活力在前酵過程中總體呈升高趨勢，僅前酵第3 天時有略微下降，和中性蛋白酶結果趨勢接近。同時考慮到纖維素酶耐高溫，在后酵過程中也可發揮作用，且其可將黃酮類成分有效轉化為黃酮苷元[12]，故認為纖維素酶也可以作為淡豆豉前酵過程的1個控制指標。總體來看，前酵第5天時酶活力增長近停滯，側面說明此時微生物生長已接近頂峰。

圖2 淡豆豉前酵過程中3種蛋白酶活力變化速率

《中華人民共和國國家標準：蛋白酶制劑》（GB/T 23527—2009）[8]中僅對測定方法的精密度和線性進行要求，本研究在試劑盒原有粗酶液提取方法的基礎上進行了優化，增加了穩定性、重復性的考察，以更好地適應淡豆豉樣品。本研究對粗酶液提取倍量、振蕩時間、每個樣品平行測定次數等提取條件進行考察，確定了最佳提取條件和檢測次數。纖維素酶活性測定過程中增加了對反應溫度、反應pH、粗酶液及糖化液加入量的考察，確定最佳提取條件。脂肪酶活力測定中，為減少銅皂法以甲苯為溶劑的實驗污染，采用滴定法測定脂肪酶含量。