新疆阿魏地上部位中的1對新的非對映異構(gòu)體△

霍曉爽，王慧娟，劉慧萍，董愛軍，王華翔，王鈞篪，斯建勇

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所/中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點實驗室，北京 100193

新疆阿魏Ferula sinkiangensisK.M.Shen 為傘形科阿魏屬植物，是僅產(chǎn)于我國新疆維吾爾自治區(qū)的藥用植物，具有消積、化瘕、散痞、殺蟲的功效，其在當(dāng)?shù)匾延袔讉€世紀(jì)的藥用歷史[1]。植物化學(xué)研究表明，香豆素、芳香酸內(nèi)酯、倍半萜內(nèi)酯及含硫化合物是新疆阿魏的主要成分[2-3]。其中倍半萜香豆素類化合物為其特征性化學(xué)成分，該類化合物主要分布于12個屬中，包括阿魏屬、胡蘿卜屬、Heptaptera屬、氨膠芹屬、蒿屬、蓍屬、菊蒿屬、春黃菊屬、黏周菊屬、大戟屬、麻風(fēng)樹屬和木橘屬[4]，特別是阿魏屬被認(rèn)為是天然倍半萜香豆素的主要來源，自1982 年以來，已報道的177 個天然倍半萜香豆素類化合物中就有約77%（135個）是從阿魏屬植物中鑒定出來[5-6]。新疆阿魏具有多種藥理活性，包括抗?jié)儭⒖寡缀涂寡趸萚7-8]，被廣泛應(yīng)用于胃腸道疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、支氣管炎等炎癥相關(guān)疾病的治療[9-10]。近年來，新疆阿魏由于其自身的生長特性，以及生長環(huán)境破壞嚴(yán)重、采收不當(dāng)?shù)纫蛩囟找鏋l危[11]。新疆阿魏常用的藥用部位為樹脂，只能通過切割根莖產(chǎn)生，且極難獲得，而易獲取的地上部位則常被丟棄，造成了極大的資源浪費。因此，若能將新疆阿魏地上部位變廢為寶，從中發(fā)現(xiàn)新的天然活性成分，將對新疆阿魏的資源利用起到極為重要的作用。本研究對新疆阿魏地上部位95%乙醇提取物的二氯甲烷部位進(jìn)行化學(xué)成分研究，分離得到了1 對新的非對映異構(gòu)體(4′R,5′S,6′R,9′R)-新疆阿魏醇A（1）和(4′S,5′R,6′R,9′R)-新疆阿魏醇A（2）；依據(jù)紫外（UV）光譜、紅外（IR）光譜、高分辨-電噴霧離子源-質(zhì)譜（HR-ESI-MS）、核磁共振（NMR）波譜等數(shù)據(jù)確定了其平面結(jié)構(gòu)和相對構(gòu)型（圖1），進(jìn)一步通過電子圓二色譜（ECD）和Mosher 法確定了其絕對構(gòu)型；采用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 炎癥模型評價其體外抗炎活性。

圖1 化合物1和2的結(jié)構(gòu)

1 材料

1.1 細(xì)胞

RAW264.7 細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

1.2 試藥

藥材于2020 年5 月采于新疆伊犁，經(jīng)新疆中藥民族藥研究所李曉謹(jǐn)研究員鑒定為新疆阿魏Ferula sinkiangensisK.M.Shen 的地上部位，標(biāo)本存放于新疆中藥民族藥研究院（標(biāo)本號：XJAWDS-202005-S）。

高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青-鏈霉素混合物均購于Gibco 公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，Hyclone 公司）；地塞米松（DEX）、LPS 均購于Sigma 公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT，北京索萊寶科技有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，Ameresco 公司）；一氧化氮（NO）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Mosher 試劑（百靈威科技有限公司）；色譜級甲醇（Fisher 公司）；其他試劑均為分析純（北京化工廠）；柱色譜硅膠（300～400、100～200目，青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20凝膠（Pharmacia Biotech公司）。

1.3 儀器

LTQ-Orbitrap XL 型質(zhì)譜儀、UV-2550 型光譜儀（Shimadzu 公司）；AV600 型核磁共振波譜儀（Bruker 公司）；LC3000 型高效液相色譜儀（北京創(chuàng)新通恒科技有限公司）；FTIR-8400S 型光譜儀（Shimadzu 公司）；341 型旋光儀（Perkin-Elmer 公司）；J-815 型圓二色譜儀（Jasco 公司）；ODS-A型色譜柱（250 mm×10 mm，50 μm，YMC 公司）；MQX200型酶標(biāo)儀（Bio Tek公司）。

2 方法

2.1 提取與分離

取新疆阿魏地上部位約8.5 kg，用95%乙醇（120 L）回流提取2 次，每次2 h。合并提取液并濾過，經(jīng)減壓濃縮干燥得浸膏約2700 g。浸膏用甲醇復(fù)溶吸附于等量的硅藻土上并完全干燥后，置于索氏提取器中依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇回流提取（每次更換溶劑時，保證前1 個極性小的溶劑充分提取），提取液減壓濃縮至稠膏狀，得到石油醚部位（200 g）、二氯甲烷部位（130 g）、乙酸乙酯部位（29 g）和甲醇部位（2100 g）。

二氯甲烷部位經(jīng)正相硅膠柱色譜（100～200目）分離，二氯甲烷-甲醇（0∶1→0∶1）梯度洗脫得到3個組分B-1、B-2和B-3。B-3組分進(jìn)一步經(jīng)正相硅膠柱色譜（300～400目），石油醚-乙酸乙酯（5∶1→0∶1）梯度洗脫，得到10 個組分（Fr.3a～3j），其中Fr.3g經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜純化后，再由半制備液相色譜進(jìn)一步分離純化，在75 min 內(nèi)經(jīng)甲醇-水（62∶38→44∶56）梯度洗脫，得到化合物1（tR=63.2 min，11 mg）和2（tR=70.5 min，12 mg）。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

使用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，于溫度37 ℃、相對濕度100%、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行各項實驗。

2.3 樣品溶液的配制

將化合物1 和2 分別用DMSO 溶解，配制成濃度為500 mmol·L-1的儲備液，分裝保存于-20 ℃，使用前用培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，并且保證DMSO的最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜0.02%。

2.4 MTT 法檢測化合物對RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響

通過MTT 法[12]檢測了受試樣品對細(xì)胞存活率的影響。將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞以1×104個/孔的密度接種于96 孔板中，分別加入終濃度為6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol·L-1的受試樣品，對照組不加樣品。在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，隨后每孔加入MTT（5 mg·mL-1）20 μL，繼續(xù)孵育4 h。棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL 溶解細(xì)胞內(nèi)的甲臜晶體。隨后用酶標(biāo)儀避光低速震蕩5 min，在570 nm 波長處檢測每孔的吸光度（A），按照公式（1）計算細(xì)胞存活率。

2.5 Griess 法檢測化合物對RAW264.7 細(xì)胞NO 釋放量的影響

取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，以2×105個/孔的密度接種于96 孔板，分別加入終濃度為6.25、12.50、25.00、50.00 μmol·L-1的受試樣品和終質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1的LPS刺激24 h。同時，設(shè)置對照組（不加樣品，不加LPS）、模型組（不加樣品，僅加入LPS）和陽性對照組（加LPS 和終濃度為10 μmol·L-1的DEX），在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)共同孵育24 h。孵育結(jié)束后，每孔取細(xì)胞上清液50 μL 分別轉(zhuǎn)移到新的96 孔板中，室溫下加入等體積的Griess試劑[13]。15 min后，使用酶標(biāo)儀在540 nm波長處檢測各孔A，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算細(xì)胞上清液中NO的含量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)解析

化合物1：無色油狀物，UV（甲醇）λmax（log ε）：323（3.78）nm；[α]20 D：+12.0（c0.1，甲醇）；HR-ESI-MS（正離子模式）給出其準(zhǔn)分子離子峰m/z:421.198 2[M+Na]+（C24H30O5Na，相對分子質(zhì)量理論值為421.199 1），推斷其分子式為C24H30O5，不飽和度為10。UV 光譜中在323 nm 處出現(xiàn)香豆素母核的特征吸收峰。1H-NMR（表1）中顯示除香豆素母核δ7.63(1H,d,J=9.5 Hz,H-4),7.39(1H,d,J=8.6 Hz,H-5),6.88 (1H,dd,J=8.6,2.4 Hz,H-6),6.84 (1H,d,J=2.4 Hz,H-8),6.28 (1H,d,J=9.5 Hz,H-3) 外，還有2 個烯氫信號δ5.23 (1H,s,H-12′b),5.08 (1H,s,H-12′a)，3 個甲基信號δ0.93 (3H,d,J=6.8 Hz,Me-13′),0.92 (3H,d,J=6.8 Hz,Me-15′),0.62 (3H,s,Me-14′)；13C-NMR（表1）顯示共有24 個碳，除去香豆素母核的9 個碳信號（δ161.7,161.2,155.9,143.9,129.1,113.7,113.1,113.1,101.8）外，還剩15 個碳，包括1 個羰基δ213.8、1 個雙鍵δ147.6,112.4（結(jié)合其氫譜的峰型及在碳譜上的化學(xué)位移，推斷其為末端雙鍵）、1個連氧次甲基δ73.6、1個連氧亞甲基δ72.1。除去香豆素母核的7 個不飽和度、1 個羰基和1 個雙鍵的2 個不飽和度，仍剩下1 個不飽和度，因此推測化合物1 可能為單環(huán)倍半萜香豆素結(jié)構(gòu)。

表1 化合物1和2的1H-NMR（600 MHz，CDCl3）和13C-NMR（150 MHz，CDCl3）數(shù)據(jù)

通過2D NMR 圖譜對化合物1 的平面結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步確證。1H-1H COSY譜中顯示自旋體系（H-2′/H-1′/H-10′、H-4′/H-13′、H-9′/H-11′、H-7′/H-6′/H-15′）的存在，結(jié)合HSQC 譜，共得到4 個結(jié)構(gòu)片段（C-2′-C-1′-C-10′、C-4′-C-13′、C-7′-C-6′-C-15′、C-9′-C-11′，圖2）。在HMBC譜中，H-11′僅與C-8′、C-9′有遠(yuǎn)程相關(guān)信號，說明該化合物的B 環(huán)為開環(huán)結(jié)構(gòu)；從H-12′與C-7′、C-8′、C-9′的遠(yuǎn)程相關(guān)信號確定了末端雙鍵的位置在8′位；此外，從H-13′與C-3′、C-4′、C-5′，H-14′與C-4′、C-5′、C-6′、C-10′，H-15′與C-5′、C-6′、C-7′的遠(yuǎn)程相關(guān)信號確定了3 個甲基及羰基的連接位置，再結(jié)合HSQC 譜得到的4個結(jié)構(gòu)片段，至此化合物1的平面結(jié)構(gòu)基本可以確定。而從H-11′與C-7的遠(yuǎn)程相關(guān)信號最終確定了倍半萜片段與香豆素的連接位置。

化合物1 倍半萜六元環(huán)部分的相對構(gòu)型可通過NOESY 譜確定，在NOESY 圖譜中可觀察到H-4′/H-14′有遠(yuǎn)程相關(guān)信號，說明其位于環(huán)的同側(cè)（圖2），進(jìn)而可確定C-4′、C-5′位的絕對構(gòu)型為4′R,5′S或4′S,5′R。但由于C-6′、C-9′位于鏈狀結(jié)構(gòu)上，不能直接通過NOESY圖譜確定其構(gòu)型，需通過進(jìn)一步的實驗確定。

圖2 化合物1和2中主要的1H-1H COSY、HMBC和NOESY相關(guān)信號

化合物1 的絕對構(gòu)型通過Mosher 法[14]并結(jié)合計算ECD 和實驗ECD 圖譜的擬合[15]來確定。首先，化合物1 中C-9′位連有1 個仲醇，其絕對構(gòu)型可通過Mosher 反應(yīng)[16]來確定。在Mosher 實驗中，化合物1與(R)-(-)-α-甲氧基苯乙酸（MPA）和(S)-(+)-α-甲氧基苯乙酸在一定條件下發(fā)生酯化反應(yīng)，生成相應(yīng)的衍生物1-(R)-MTPA（1a）和1-(S)-MTPA（1b）。基于該反應(yīng)符合MTPA應(yīng)用規(guī)則[17]，從圖3中可以看出化合物1 所形成的非對映異構(gòu)體1a 和1b 之間的1H-NMR 化學(xué)位移變化（ΔδSR）有明顯差異，因此可確定C-9′位的絕對構(gòu)型為R構(gòu)型。

圖3 化合物1的S-、R-MTPA-Mosher酯的構(gòu)象及由此得到的Δδ值（Hz）在化合物1“前”和“后”兩側(cè)的分布

基于以上結(jié)果，化合物1可能存在4種絕對構(gòu)型（4′R,5′S,6′R,9′R、4′R,5′S,6′S,9′R、4′S,5′R,6′R,9′R、4′S,5′R,6′S,9′R），最終通過計算ECD 和實驗ECD 圖譜擬合匹配的方法進(jìn)行確定。首先進(jìn)行蒙特卡羅構(gòu)象搜索，并選擇波爾茲曼分布＞5%的構(gòu)象，在B3LYP/6-31+g (d) 水平上，以甲醇為溶劑采用密度泛函理論（DFT）進(jìn)行構(gòu)象優(yōu)化，然后在B3LYP/6-311+g (d,p)水平上，以甲醇為溶劑采用含時密度泛函理論（TD-DFT）進(jìn)行能量計算，計算了60個激發(fā)態(tài)的轉(zhuǎn)子強(qiáng)度。最后使用SpecDis 1.7和GraphPad Prism 8，設(shè)定sigma 值為0.2 eV，擬合生成計算ECD 圖譜。最終的計算ECD 圖譜結(jié)果顯示4′R,5′S,6′R,9′R構(gòu)型的計算ECD 圖譜與實驗ECD 圖譜趨勢較為吻合（圖4），故確定化合物1 的絕對構(gòu)型為4′R,5′S,6′R,9′R（圖1），并將其命名為(4′R,5′S,6′R,9′R)-ferusingenol A，給出通俗名稱為(4′R,5′S,6′R,9′R)-新疆阿魏醇A。

圖4 化合物1和2的實驗ECD和計算ECD圖譜

化合物2：無色油狀物，UV（甲醇）λmax（log ε）：323（3.47）nm；[α]20 D：-5.0°（c0.1，甲醇）；HR-ESI-MS（正離子模式）給出其準(zhǔn)分子離子峰m/z：421.197 9[M+Na]+（C24H30O5Na，相對分子質(zhì)量理論值為421.199 1），與化合物1 相對分子質(zhì)量相同。其1H-和13C-NMR 特征與化合物1也基本一致，以上結(jié)果說明化合物2 可能為化合物1 的非對映異構(gòu)體。NOSEY 圖譜顯示H-4′/H-14′有遠(yuǎn)程相關(guān)信號，說明它們同樣位于環(huán)的同側(cè)，因此C-4′、C-5′位的絕對構(gòu)型可能為4′R,5′S或4′S,5′R，與化合物1 一致；同樣用Mosher 反應(yīng)可確定其C-9′位的絕對構(gòu)型為R構(gòu)型。最后C-4′、C-5′和C-6′位的絕對構(gòu)型通過計算ECD和實驗ECD圖譜的擬合匹配來確定，結(jié)果顯示，4′S,5′R,6′R,9′R構(gòu)型的計算ECD 圖譜與實驗ECD 圖譜趨勢較為吻合（圖4），因此可確定化合物2 為化合物1 的非對映異構(gòu)體，并將其命名為(4′S,5′R,6′R,9′R)-ferusingenol A，給出通俗名稱為(4′S,5′R,6′R,9′R)-新疆阿魏醇A。

3.2 體外抗炎活性篩選

3.2.1化合物對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響 如圖5所示，經(jīng)MTT 法檢測發(fā)現(xiàn)，濃度在50.00 μmol·L-1以下時，化合物1 和2 對RAW264.7 細(xì)胞增殖影響較小。

圖5 化合物1和2對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響（,n=3）

3.2.2化合物對RAW264.7細(xì)胞NO生成的影響 如圖6所示，與對照組比較，模型組NO 生成量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，化合物1 和2 在濃度為50 μmol·L-1時，作用于RAW264.7 細(xì)胞24 h 后，NO 生成量均明顯降低（P＜0.01）；尤其是化合物1在濃度為50.00 μmol·L-1時與DEX（10.00 μmol·L-1）效果相當(dāng)。

圖6 化合物1和2對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞NO產(chǎn)生的影響（, n=3）

4 討論

本研究從新疆阿魏地上部位95%乙醇水提取物的二氯甲烷部位中分離得到1 對新的非對映異構(gòu)體，并對其體外抗炎活性進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對LPS刺激的RAW264.7 細(xì)胞具有不同程度的抗炎活性，這不僅豐富了阿魏屬的化學(xué)成分，尤其是倍半萜香豆素類化合物，還為其抗炎活性的研究提供了參考，在一定程度上對新疆阿魏資源的充分利用起到了積極的作用。