尿毒癥大鼠肌少癥模型的造模方法及評價(jià)

吳永耀，余日臻，孫京華，閆迎華，張豪杰，劉江，裘曉蕙

肌少癥是一種隨年齡增長而發(fā)生的骨骼肌下降，以骨骼肌質(zhì)量、力量及功能降低為主要特征的退行性綜合征[1]。臨床表現(xiàn)為肌力減退，日?；顒邮芟?，易致跌倒骨折發(fā)生，大大增加死亡風(fēng)險(xiǎn)[2]。與增齡相關(guān)的肌少癥相比，尿毒癥伴隨肌少癥臨床預(yù)后更差，死亡率更高[3]。因此，建立尿毒癥肌少癥的動物模型就顯得十分重要。慢性限制性應(yīng)急，是一種慢性制動聯(lián)合禁食的造模方法，是廣泛被運(yùn)用到情志動物模型的制作[4]，結(jié)合尿毒癥患病后的臨床特點(diǎn)[5]，對尿毒癥大鼠進(jìn)行慢性限制，更加接近尿毒癥患者病后的一般狀態(tài)，從肌少癥病因?qū)W的多角度進(jìn)行干預(yù)。為此，筆者擬在5/6腎臟切除尿毒癥動物模型基礎(chǔ)上聯(lián)合慢性限制性應(yīng)急，建立尿毒癥肌少癥動物模型，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取18個月齡雄性中老年大白鼠35只，體質(zhì)量305～317 g，由寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，飼料喂養(yǎng)3 d適應(yīng)環(huán)境后造模。

1.2 動物模型的建立

1.2.1 慢性腎功能衰竭模型制造25只大鼠按經(jīng)典的兩步法行5/6腎切除術(shù)，一期手術(shù)切除約左腎體積的5/6；1周后，二期手術(shù)切除右側(cè)腎臟。二期手術(shù)后4周，達(dá)到尿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)的有20只，隨機(jī)分成兩組：5/6腎切除組（尿毒癥組，=10），5/6腎切除+慢性限制性活動組（造模組，=10）。余下10只大鼠為假手術(shù)組（對照組，=10），采用2次手術(shù)法，手術(shù)僅打開腎包膜，暴露腎臟約5 min后縫合肌層及皮膚。3組大鼠術(shù)后分籠飼養(yǎng)于室溫18～25℃通風(fēng)良好的環(huán)境中，正常飲食喂養(yǎng)4周，自由進(jìn)食、飲水。

1.2.2 肌少癥模型制造（尿毒癥聯(lián)合慢性限制性應(yīng)急）將尿毒癥大鼠置于束縛制動筒內(nèi)，通過移動插片逐步縮小大鼠的活動空間，調(diào)節(jié)到其不產(chǎn)生強(qiáng)烈反抗的程度，每天束縛制動1次，第1天為4 h，其后根據(jù)大鼠一般情況適當(dāng)增減，期間監(jiān)測一般情況、體質(zhì)量變化，連續(xù)16周。造模大鼠在制動期間禁食、不禁水（圖1）。肌少癥診斷標(biāo)準(zhǔn)參照Baumgartner等[6]的方法，模型組SI值與對照組相比顯著降低，且差異大于2倍SD判定模型成功。SI值定義為靶骨骼肌的質(zhì)量（mg）/受試體質(zhì)量（g）求得的值。本研究以腓腸肌作為靶肌肉，使用SI作為評價(jià)指標(biāo)來判斷肌肉減少癥動物模型成功與否。

圖1 尿毒癥聯(lián)合慢性限制性造模法

1.3 前肢抓力測量 將大鼠前肢平放在電子抓力儀的感應(yīng)桿上，當(dāng)大鼠牢牢抓住感應(yīng)桿后，平行拖拽大鼠尾巴，直到松開為止，抓力儀會自動記錄大鼠的最大抓力。重復(fù)測量3次，取最大值為大鼠的抓力，每2周測量1次。

1.4 觀察指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)期間每天觀察大鼠的一般情況，包括外形、精神狀態(tài)及食欲等。體質(zhì)量指標(biāo)檢測每2周稱重1次。

1.5 腓腸肌組織及血液標(biāo)本的留取在16周末對3組大鼠進(jìn)行取材，處死大鼠后，取大鼠腓腸肌稱重，計(jì)算SI比值，并行HE染色法在400倍下拍照獲得圖像。用Image pro 6.0軟件對切片圖像進(jìn)行分析，測量細(xì)胞的平均橫截面積。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，多重比較采用SNK檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)期間共有3個大鼠死亡（均在行5/6腎臟切除術(shù)后），經(jīng)尸體解剖檢查，考慮為術(shù)后止血不徹底及合并腹腔感染所致。二期5/6腎切除初期，大鼠活動量明顯減少，體質(zhì)量下降，4周后體質(zhì)量趨于穩(wěn)定。造模組初期，大鼠出束縛制動筒后處于易激惹狀態(tài)，而后期出現(xiàn)活動及飲食量明顯減少、反應(yīng)遲鈍、蜷縮拱背、精神萎靡等情緒和行為的改變，與對照組和尿毒癥組形成明顯的反差。

2.2 抓力影響 實(shí)驗(yàn)前8周，3組間抓力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（≤1.912，＞0.05），從第8周開始，造模組抓力出現(xiàn)逐漸下降的趨勢，第16周時(shí)造模組抓力小于對照組（=4.42＜0.05）；尿毒癥組亦較對照組有所減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。見圖2。

圖2 造模期間各組大鼠大鼠抓力變化情況

2.3 大鼠體質(zhì)量、腓腸肌重量及SI比值變化 對照組大鼠體質(zhì)量逐漸增加；尿毒癥組造模前4周體質(zhì)量下降，6周后體質(zhì)量趨于穩(wěn)定；造模組大鼠體質(zhì)量從第10周開始出現(xiàn)明顯減少，至第16周時(shí)體質(zhì)量顯著減少（=7.5363＜0.05），見圖3。第16周時(shí)，造模組大鼠腓腸肌重量低于其他兩組（=3.675＜0.05）；見圖4。第16周時(shí)，造模組SI值較對照組顯著下降（=6.32＜0.05），且下降幅度大于2倍SD，提示造模組大鼠肌肉減少癥模型成功；尿毒癥組SI值較對照組有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），造模組SI值與尿毒癥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=3.95＜0.05），見圖5。

圖3 各組大鼠體質(zhì)量變化情況

圖4 16周末各組大鼠腓腸肌重量情況

圖5 16周末各組大鼠SI比值情況

2.4 大鼠腓腸肌細(xì)胞橫截面積變化第16周時(shí)，造模組腓腸肌細(xì)胞橫截面積低于尿毒癥組和對照組（=23.35，＜0.05），尿毒癥組與對照組比較有所減少，但差異不明顯。肌細(xì)胞橫斷面積的變化與腓腸肌重量的改變相一致，見圖6。

圖6 16周末各組大鼠腓腸肌細(xì)胞橫截面積情況

3 討論

肌少癥在尿毒癥血液透析患者中發(fā)病率逐漸增高，目前普遍認(rèn)為與酸中毒、微炎癥狀態(tài)、蛋白質(zhì)-能量消耗等因素密切相關(guān)，是多種風(fēng)險(xiǎn)因素與相關(guān)發(fā)病機(jī)制相互作用的結(jié)果[7-9]。臨床發(fā)現(xiàn)尿毒癥患者肌少癥患病率極高，考慮除了尿毒癥疾病相關(guān)外，還與患病后運(yùn)動缺乏，食欲下降，以及存在焦慮抑郁心理相關(guān)。長期的運(yùn)動缺乏、攝食減少及心理應(yīng)激狀態(tài)下肌肉組織結(jié)構(gòu)功能均會發(fā)生改變，表現(xiàn)為肌力的減少及萎縮樣變化[10-11]。本研究結(jié)合尿毒癥的臨床特點(diǎn)，將尿毒癥大鼠放置于束縛制動筒內(nèi)，限制其自由活動及飲食，使其正常生存本能受阻而不能表達(dá)，從肌少癥病因?qū)W的多角度進(jìn)行干預(yù)，使之更加接近肌少癥的特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與其他組相比，造模組大鼠體質(zhì)量在第16周時(shí)顯著減少；同時(shí)，大鼠腓腸肌重量也顯著下降；SI值較對照組顯著下降，且下降幅度大于2倍SD，提示采用5/6腎切除+慢性限制性活動在第16周即可造模成功。與其他組相比，造模組大鼠從第8周開始出現(xiàn)抓力下降，在第16周時(shí)，抓力顯著減少（＜0.05）；而大鼠體質(zhì)量從第10周才開始出現(xiàn)減少，至第16周時(shí)除體質(zhì)量明顯下降外，大鼠腓腸肌大小、重量及肌細(xì)胞橫截面積均也顯著下降（＜0.05），這提示大鼠肌肉功能變化先于其形態(tài)變化。肌少癥發(fā)生除了常見尿毒癥致病因素外，運(yùn)動、攝食減少及慢性心理應(yīng)激也在其發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用。本動物模型采用在尿毒癥基礎(chǔ)上聯(lián)合慢性限制性應(yīng)急在第16周時(shí)即可成功制造肌少癥動物模型，該模型除了可以了解尿毒癥肌肉萎縮改變外，也可以在去除慢性限制性應(yīng)急后建立尿毒癥肌少癥逆轉(zhuǎn)模型。與傳統(tǒng)的造模方法相比，如衰老引發(fā)的肌少癥需要20～24個月才能實(shí)現(xiàn)[12]。而下肢懸吊法以懸吊側(cè)肢體萎縮為主，對懸吊側(cè)肢體損傷較大，動物死亡率高，在去除懸吊解除后很難逆轉(zhuǎn)肌少癥?；蚯贸齽游锬Ｐ?，雖能夠反映衰老的特征，然而炎癥參與肌肉減少的支持缺乏依據(jù)[13]。與傳統(tǒng)方法相比，本造模方法具有死亡率低，成模周期短，簡單方便易操作，肌少癥逆轉(zhuǎn)模型容易實(shí)現(xiàn)等優(yōu)點(diǎn)。

綜上所述，采用尿毒癥大鼠聯(lián)合慢性限制性活動能較好地模擬肌少癥過程，動物死亡率低，造模周期短，過程方法簡單方便、易實(shí)現(xiàn)，為今后研究肌少癥的發(fā)病機(jī)制及防治方法提供基礎(chǔ)。