剔除目標成分的丹參注射液對大鼠嗜堿性粒細胞白血病細胞和大鼠過敏反應的影響

顏 倩，曹佩琳，劉 奕

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院口腔科，四川 成都，610072)

口腔黏膜下纖維化(oral submucosa fibrosis，OSMF)是一種慢性、隱匿性疾病，以口腔和口咽部黏膜下纖維化為特征[1]。據報道，丹參注射液對OSMF具有一定的治療作用[2]。丹參注射液是由Radix S miltiorrhiza的提取物制成，具有抗氧化、抗炎、抗血凝、抗血栓、抗腫瘤、免疫增強以及抗纖維化等作用[3]。丹酚酸A、丹酚酸B和丹參酮IIA是丹參注射液的重要活性化合物。這三種活性化合物在體外都有很好的抗纖維化活性[4]。然而，丹參注射液可引起速發型超敏反應[4]。因此，降低丹參注射液在OSMF治療過程中引起的過敏反應對OSMF的治療效果具有重大意義。本研究于2021年10月至2022年3月通過核酸適體技術剔除丹參注射液中的目標成分，以期降低大鼠和嗜堿性粒細胞白血病(RBL-2H3)細胞的過敏反應。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD大鼠(雄性，SPF級)購買于南方醫科大學實驗動物中心，許可證號SCXK(粵)2021-0041。大鼠被分開養在籠子里，溫度為(23±2)℃，濕度為55%。動物實驗是在四川省人民醫院動物護理和使用委員會的機構準則下進行的[倫審(研)2022年第226號]。

1.2 主要試劑大鼠嗜堿性粒細胞白血病細胞(RBL-2H3)購于ATCC；MEM培養液和胎牛血清(FBS)購自于美國Gibco公司；p-anti-p38、p-cJNU、p-Syk和GAPDH抗體購自Abcam公司；DNP-BSA抗原和DNP特異性IgE購自美國Sigma-Aldrich公司；蛋白質測定試劑盒購自碧云天公司；PVDF膜購自美國Bio-Rad Laboratories公司；化學發光試劑購自MILLIPORE公司；蘇木精購自北京安諾倫公司；伊紅購自英國Leica Microsystems公司；丹參注射液購買于廣東永康藥業有限公司(產品批號：0409007)；剔除目標成分的丹參注射液由廣州醫科大學附屬口腔醫院楊會肖饋贈。

1.3 方法

1.3.1細胞培養 采用MEM培養液(10% FBS+1%雙抗)進行RBL-2H3細胞培養和傳代，培養條件為37 ℃、5% CO2。

1.3.2細胞處理 RBL-2H3細胞被接種于6孔板，培養基中分別加入25、50及100 μl/ml丹參和剔除目標成分后的丹參注射液培養24小時。正常培養24小時后的RBL-2H3細胞作為陰性對照組。陽性對照為培養基中給予200 ng/ml二硝基苯胺(DNP)特異性IgE培養24小時。

1.3.3流式細胞儀檢測 各組細胞懸液與AnnexinV工作液共同孵育，流式細胞儀檢測AnnexinV陽性細胞率，即為不同處理組細胞脫顆粒率。

1.3.4β-氨基己糖苷酶釋放試驗 將RBL-2H3細胞(1×106個細胞/孔)接種在24孔板中，并用200 ng/ml DNP特異性IgE處理細胞。按照實驗目的處理后，將各組細胞暴露于200 ng/ml的DNP-BSA抗原中，并在37℃ 孵育15 min。通過測量釋放的β-氨基己糖苷酶的數量來確定脫顆粒的程度。

1.3.5ELISA 收集各組RBL-2H3細胞培養液。在小鼠治療結束時，收集小鼠血液，在4 ℃下以5000 g快速離心10分鐘。上清液保存在-20 ℃。根據試劑盒說明書，使用組胺ELISA試劑盒。

1.3.6免疫印跡 使用RIPA緩沖液提取各組RBL-2H3細胞中的總蛋白，并用蛋白質檢測試劑盒測定蛋白質濃度。采用SDS-PAGE(8%凝膠)對等量的蛋白質樣品(40 μg)進行分離，并將目的蛋白電轉到PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉后，膜與一抗(anti-p-anti-p38、anti-p-cJNU、anti-p-Syk, and anti-GAPDH)在4 ℃下雜交過夜。洗滌后，膜與辣根過氧化物酶標記的二抗在室溫下孵育2 h。增強型化學發光試劑處理后，利用凝膠成像儀對目的蛋白進行曝光顯影。

1.3.7動物處理 對SD大鼠進行I類過敏反應，將雄性SD大鼠隨機分別為丹參注射液組，剔除目標成分后注射液組、正常組和陽性對照組(天花粉蛋白)，每組各8只。將各受試樣品按照臨床等倍劑量腹腔注射給予SD大鼠，丹參注射液組以及剔除目標成分后注射液組用藥劑量為2 ml/kg，注射容積按體重計算，0.5 ml/200 g。隔日注射1次，連續三次進行致敏反應。陽性對照組天花粉蛋白的濃度為24 μg/ml，注射劑量為0.5 ml。同樣的注射方式，正常組注射等量的生理鹽水。末次注射14天后進行第一次攻擊實驗，攻擊劑量等同致敏劑量倍，注射容積為致敏時的2倍，注射方式為一次性尾巴靜脈推注。攻擊實驗60 min后二氧化碳窒息法處死大鼠，對背部皮膚伊文思藍染色情況進行拍照，并將皮膚剪碎后用組織浸出液(丙酮∶生理鹽水=7∶3)浸泡48 h，取上清液測量其610 nm處OD值，計算皮膚中依文思藍染料的滲出量。提取各組大鼠血清及肺組織進行組胺和總IgE測定。摘取肺組織，進行包埋固定及HE染色

1.3.8IgE水平的檢測 攻擊實驗60 min后，采用心臟取血法取各組大鼠血液1 ml，離心后置于-20 °C冰箱。使用全自動生化分析儀(AU5800)對血清IgE水平進行測定。

1.3.9HE染色 所有大鼠肺組織樣品用4%多聚甲醛固定24 h，并進行包埋、切片(4 μm)、脫蠟、復水處理。切片用蘇木精染色10 min，0.1%伊紅染色30 s。沖洗后，切片被進行二甲苯透明和梯度酒精脫水。中性樹膠固定后，切片用光學顯微鏡拍攝病理觀察。切片由2名經驗豐富的病理學家通過雙盲閱讀進行評估。

1.4 統計學方法所有統計分析均使用SPSS 20.0軟件進行。計量數據用均數±標準差表示。比較各組數據時使用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度丹參和剔除目標成分后的丹參注射液對RBL-2H3細胞的脫顆粒率，β-氨基己糖苷酶釋放率和組胺含量的影響與陰性對照組相比，丹參組和剔除目標成分后的丹參組細胞的脫顆粒率顯著升高、β-氨基己糖苷酶釋放率、組胺含量顯著增加；與丹參組相比，剔除目標成分后的丹參組細胞的脫顆粒率明顯降低，β-氨基己糖苷酶釋放率、組胺含量明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同濃度丹參和剔除目標成分后的丹參注射液對RBL-2H3細胞脫顆粒率、β-氨基己糖苷酶釋放率和組胺含量的影響

2.2 不同濃度丹參和剔除目標成分后的丹參注射液對RBL-2H3細胞中p-p38、p-cJNU和p-Syk的表達的影響與陰性對照組比，使用25、50、100 μl/ml丹參和剔除目標成分后的丹參注射液處理的RBL-2H3細胞p-p38、p-cJNU和p-Syk相對表達水平顯著上調；相同濃度的丹參和剔除目標成分后的丹參注射液干預下，與丹參組比較，p-p38、p-cJNU和p-Syk的相對表達水平在剔除目標成分后的丹參組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1和表2。

表2 RBL-2H3細胞中p-p38、p-cJNU和p-Syk蛋白表達的定量分析

2.3 剔除目標成分丹參注射液對SD大鼠被動阿瑟斯反應和肺組織的影響伊文思藍染色結果顯示，與正常組組比，OD610 nm在丹參和剔除目標成分后的丹參注射組顯著升高；與丹參注射組比，OD610 nm在剔除目標成分后的丹參注射組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。HE染色結果顯示，陽性對照組肺組織內血管擴張充血，肺泡腔擴張，黏膜上皮呈脫落壞死，炎性細胞聚集；與正常組比較，丹參和剔除目標成分后的丹參注射組的炎癥細胞有所增加；與丹參注射組比，炎癥細胞數量在剔除目標成分后的丹參注射組明顯地降低(圖2)。

2.4 剔除目標成分的丹參注射液對SD大鼠血清和肺組織總IgE及組胺含量的影響丹參和剔除目標成分后的丹參注射液的處理可明顯增加SD大鼠血清和肺組織中的組胺含量；與丹參注射組比，血清組胺含量在剔除目標成分后的丹參注射組明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。丹參注射液和剔除目標成分后的丹參注射液的處理也可顯著地升高總IgE在 SD大鼠血清和肺組織中的濃度；而與丹參注射組比，總IgE濃度在剔除目標成分后的丹參注射組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表3 四組皮膚伊文思藍染色OD610 nm比較

表4 丹參和剔除目標成分后的丹參注射液對SD大鼠血清和肺組織中組胺及總IgE含量的比較

3 討論

OSMF是一種慢性隱匿性疾病，被認為是一種口腔癌前病變[5]。OSMF主要表現為張口和舌頭運動困難，有燒灼感，口腔黏膜纖維化，進而導致患者飲食限制，語言障礙，難以保持口腔健康[6]。據報道，OSMF與遺傳，免疫，辣椒攝入和營養缺乏等因素有關[7]。流行病學證據表明，咀嚼檳榔是OSMF最重要的風險因素之一[8]。目前，OSMF的治療方法主要包含物理治療、高壓氧治療和手術治療等，然而，其治療效果較低[9]。因此，確定一種治療OSMF的有效藥物是必要的。

在傳統中醫理論中，OSMF與 "淤血病 "有關。這個術語主要是基于促進血液循環以消除血瘀的特殊治療方法。丹參注射液是傳統中醫治療中的一種常規藥物，主要有丹參素、丹參酮、原兒茶醛等主要活性成分具有具有抗氧化、抗血凝、抗血栓、抗脂蛋白、抗炎、抗雄性激素、抗腫瘤、免疫增強以及抗纖維化的作用[10,11]，對活血散瘀非常有效[12]。鄒萍等研究發現，丹參注射液可以促進OSMF凋亡，并且具有劑量和時間依耐性[13]。丹參注射液中的丹參酮ⅡA、丹參素、丹參多酚酸鹽、原兒茶醛等能顯著抑制成纖維細胞增殖[14]。采用丹參注射液局部黏膜下注射對OSMF具有一定的療效，可改善OSMF的癥狀[15,16]，具有臨床治療推廣價值。然而，丹參注射液具有多種不良反應，其主要不良反應為速發型超敏反應，包括I型過敏反應和類過敏反應，可累及神經、心血管、呼吸、消化、泌尿等多個系統[17]，嚴重限制了丹參注射液在OSMF中的臨床應用，因此深入開中藥毒性成分及其與有效成分之間關系的研究，優化化學成分配伍，減少不良反應、提高治療效率，對臨床應用丹參注射液治療OSMF具有重要意義。肥大細胞通過IgE特異性受體受到IgE調節抗原的刺激，激活下游的交聯受體、Syk、Gab2和其他酪氨酸激酶，從而引起過敏反應[18,19]。因此，Syk和Gab2是被認為是開發抗過敏藥物的理想靶點。在RBL-2H3細胞中，可以通過檢測細胞的脫顆粒率、細胞超微結構變化、細胞上清液中的組胺、β-氨基己糖苷酶的釋放等指標綜合評價藥物所致類過敏反應的潛在能力[20]。p38、cJUN、Sky信號通路的激活在過敏反應中發揮重要作用[19]。在研究中發現丹參注射液可增加RBL-2H3細胞的脫顆粒率、β-氨基己糖苷酶釋放率、組胺含量和p-p38、p-cJNU和p-Syk蛋白表達。同時，丹參注射液可增強SD大鼠被動阿瑟斯反應、肺組織病理損傷、SD大鼠血清和肺組織中組胺含量和總IgE濃度。本研究結果進一步證實，丹參注射液可引起強烈的過敏反應。

研究發現，丹參注射液的一些成分，如丹參酮可與酸性結晶體作為半抗原與血漿蛋白結合而具免疫原性，從而引起機體發生過敏反應；一些帶酚羥基的酸性成分如原兒茶酚醛及丹參素等，與鞣質的化學成分相似，可作為半抗原與血漿蛋白的氨基締合成更大分子復合物而引起變態反應，導致過敏反應或過敏性體克[21]。因此，剔除丹參注射液中可致敏的一些目標成分也許可減少丹參注射液的不良反應、提高其治療效率。目標成分剔除法是一種減法的策略，采用一定的方法將某種特定成分除去，同時不影響其他組分，獲得剔除目標成分后的中藥組分。我們通過核酸適體技術剔除目標成分，篩選得到丹參注射液中三種主要活性成分丹參素、丹參酮IIA、原兒茶醛的核酸適體，獲得目標成分剔除后的丹參注射液。此外，本文結果證實，相對于丹參注射液，剔除目標成分后的丹參注射液可明顯降低大鼠和RBL-2H3細胞的過敏反應。

綜上所述，剔除目標成分可降低丹參注射液所引起過敏反應。這一研究結果為能為丹參注射液在OSMF的治療提供新思路。