術前血清miR-135b、miR-141水平對結直腸癌根治術后預后的評估價值分析

賴箭波

結直腸癌在全世界范圍內的發病率和死亡率位居惡性腫瘤前列，而近年來隨著人民飲食結構等生活方式的改變，其在我國的發病率及死亡率均處于上升階段［1］。目前，結直腸癌根治術仍是臨床首選的治療手段。但根據全球腫瘤調查報告數據，每年仍有超過88 萬結直腸癌患者死亡，約占癌癥死亡例數的10%，預后效果仍未達預期［2］。因此，為進一步優化結直腸癌患者的診療措施，尋找行結直腸癌根治術患者的潛在預后因子的臨床意義深遠。miRNA 作為一類長度為18～25 個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA，可在轉錄后通過特異性調控靶基因表達，從而參與機體的多種生理及病理過程［3］。研究表明［4］，miRNA 的異常表達與腫瘤的發生、發展，侵襲及轉移有關，提示檢測腫瘤患者的血清miRNA 水平可能有助于疾病的早期診斷與預后評估。Zhang 等［5］研究發現，循環血miR-135b 在結直腸癌患者中的表達明顯高于健康者；Ardila 等［6］也指出，血清miR-141 在結直腸癌組織中的含量顯著升高。本研究旨在探討術前血清miR-135b、miR-141 水平對結直腸癌根治術后預后的評估價值，以期為臨床運用提供依據。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以2018年1月至2019年4月于深圳市人民醫院胃腸外科行結直腸癌根治術的106 例結直腸癌患者為研究組。納入標準：①均經術后病理組織學診斷證實為結直腸癌；②均行結直腸癌根治術治療，且術前未接受化療等其他抗腫瘤治療者；③均有記錄完整的病例資料及隨訪記錄。排除標準：①合并其他惡性腫瘤者；②為繼發性結直腸癌；③存在梗阻、穿孔而行急診手術者；④合并血液系統疾病者。其中男性65 例，女性41 例；年齡平均（61.37±7.85）歲；淋巴結轉移：有60 例，無46例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期36 例，Ⅲ～Ⅳ期70 例；分化程度：低分化42 例，中、高分化64 例；腫瘤位置：結腸50 例，直腸56 例。另選同期于本院行健康體檢的100 名體檢者為對照組，研究組和對照組的年齡、性別等基線資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），有可比性。本研究經院醫學倫理委員會批準通過，受試者或家屬已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-135b、miR-141 檢測

收集研究組所有患者和對照組術前1 周的空腹靜脈血5 mL，在離心半徑10 cm、轉速1 000 r/min 下離心10 min，取上層血清，置于-80℃儲存待測。采用購自美國賽默飛公司的miRNA 提取試劑盒、miRNA 逆轉錄試劑盒，嚴格按照說明書進行操作，提取血清中的總miRNA 并逆轉錄成cDNA，并采用實時熒光定量PCR 法檢測血清miR-135b、miR-141 水平。PCR 反應體系為25，內參為GAPDH，反應條件為預變性95℃10 min；變性95℃15 s；退火60℃1 min；共40 個循環。結果取3 個樣本復孔的均值。血清miR-135b、miR-141 表達量采用2-ΔΔCt法進行計算。

1.2.2 臨床資料收集

收集研究組所有患者的相關臨床資料，包括患者的性別、年齡、是否合并高血壓、是否合并糖尿病、有無淋巴結轉移、TNM 分期、分化程度、腫瘤位置、腫瘤直徑等。

1.2.3 隨訪

研究組患者術后至少隨訪3年，采用電話、微信和門診方式進行隨訪，術后1年每3 個月隨訪1次，2年以后每間隔6 個月隨訪一次。本研究中末次隨訪截止日期為2022年4月30日。總生存時間（overall survival，OS）定義為從手術結束至患者因任何原因引起的死亡或末次隨訪的時間，無病生存期（disease-free survival，DFS）定義為從手術結束至患者出現腫瘤復發或轉移或因疾病進展導致死亡的時間。

1.3 統計學方法

應用SPSS 21.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料以（±s）表示，行t檢驗；計數資料以n（%）表示，采用χ2檢驗。采用受試者工作特征曲線（ROC）來確定血清miR-135b、miR-141 對OS 的最佳界值；并以Cox風險比例模型分析影響患者生存預后的影響因素。以Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并以Log-Rank法進行組間生存差異檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究組和對照組術前血清miR-135b、miR-141比較

研究組結直腸癌患者術前血清miR-135b、miR-141 表達明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 研究組和對照組術前血清miR-135b、miR-141比較（±s）Table 1 ComparisonofserummiR-135bandmiR-141between study group and control group before operation（±s）

表1 研究組和對照組術前血清miR-135b、miR-141比較（±s）Table 1 ComparisonofserummiR-135bandmiR-141between study group and control group before operation（±s）

組織研究組對照組t 值P 值n 106 100 miR-135b 1.90±0.54 0.98±0.42 13.564＜0.001 miR-141 1.03±0.36 0.82±0.31 4.475＜0.001

2.2 術前血清miR-135b、miR-141 的最佳界點

本研究共納入106 例結直腸癌患者，術后3年OS 生存率為79.25%（84/106），術后3年DFS 生存率為73.58%（78/106）。以OS 為狀態變量，術前血清miR-135b、miR-141 的最佳界值分別為2.215、1.120。見表2、圖1。

表2 術前血清miR-135b、miR-141 對OS 的診斷價值Table 2 Preoperative diagnostic value of serum miR-135b and miR-141 for OS

圖1 ROC 曲線Figure 1 ROC curve

2.3 術前血清miR-135b、miR-141與臨床特征的關系

根據血清miR-135b、miR-141 的最佳界值，把所有患者分為miR-135b≥2.215 組、miR-135b＜2.215組和miR-141≥1.120 組、miR-141＜1.120 組，術前血清miR-135b、miR-141 均與患者的TNM 分期、分化程度、淋巴結轉移有關（均P＜0.05）。見表3。

表3 術前血清miR-135b、miR-141 與臨床特征的關系［n（%）］Table 3 Relationship between serum miR-135b and miR-141 and clinical features before surgery［n（%）］

2.4 DFS 的單因素和多因素Cox 回歸分析

Cox 回歸分析顯示，血清miR-135b、miR-141及TNM 分期是患者術后DFS 的獨立影響因素（P＜0.05）。見表4。

表4 DFS 的單因素和多因素Cox 回歸分析Table 4 Univariate and multivariate Cox regression analysis of DFS

2.5 OS 的單因素和多因素Cox 回歸分析

Cox 回歸分析顯示，血清miR-135b、miR-141及TNM 分期是患者術后OS 的獨立影響因素（P＜0.05）。見表5。

表5 OS 的單因素和多因素Cox 回歸分析Table 5 Univariate and multivariate Cox regression analysis of OS

2.6 生存曲線分析

根據血清miR-135b、miR-141 的最佳界值，把所有患者分為miR-135b≥2.215 組、miR-135b＜2.215 組和miR-141≥1.120 組、miR-141＜1.120 組，Kaplan-Meier法繪制生存曲線OS 和DFS 生存函數曲線并行Log-Rank檢驗，miR-135b≥2.215 組、miR-141≥1.120 組具有更低的DFS 和OS。見圖2。

圖2 生存曲線Figure 2 Survival curves

3 討論

miRNA 可以通過與靶mRNA 上的部分互補位點進行堿基配對來抑制基因表達，從而引發RNA降解或損害翻譯。大量研究顯示［7-8］，miRNA 可調節多種生物學功能，并且通常在病理條件下異常表達，如其可參與調節腫瘤發生、細胞增殖、凋亡和化學敏感性。目前，雖然關于miRNA 進入循環血液中的機制尚未完全明確，但通過PCR 法可檢測到穩定的miRNA 并可將其量化，因此miRNA 有望成為腫瘤早期診斷和預后預測的生物標志物。本文回顧性分析了術前血清miR-135b、miR-141 在行結直腸癌根治術患者預后中的作用，通過ROC曲線的最佳界點對血清miR-135b、miR-141 進行二分類，進一步進行單因素和多因素的Cox 分析，并繪制OS 和DFS 的生存曲線，最終得出結論，即術前血清miR-135b、miR-141 是預測結直腸癌患者根治術后預后的有效標志物。

miR-135b 位于染色體1q32.1，在多種惡性腫瘤如結直腸癌、胃癌、肺癌等中明顯過表達，可通過參與調控不同靶基因而在不同腫瘤的進展過程中發揮重要作用。張小鴻等［9-10］的研究顯示，miR-135b可通過調控PTEN/PI3K/AKT 信號通路來影響結腸癌細胞的凋亡；同時可以通過mTOR/p70S6K 信號通路使細胞周期發生阻滯。提示miR-135b 可作為一種促癌基因參與結直腸癌的生長過程。目前國內外相關研究多集中在腫瘤組織或糞便中，如Li 等［11］的研究指出，miR-135b 在結直腸癌患者糞便中表達顯著上調，并與結直腸癌細胞的侵襲遷移有關。Moghadamnia 等［12］采用實時定量PCR 技術分析結直腸腫瘤組織和正常鄰近組織中7 種結直腸癌相關的miRNA，結果顯示miR-135b 在結直腸癌組織中的表達顯著過表達。但關于血清miR-135b 在結直腸癌中的報道仍鮮見報道。袁平等［13］的研究指出，血清miR-135b 在結直腸癌患者中的表達量較正常健康者明顯升高，并與結直腸癌的惡性程度、淋巴結轉移的關系密切，與本研究結果基本一致。miR-141 在不同的癌癥類型中可發揮抑癌或促癌作用，如在結直腸癌、肺癌、卵巢癌中顯著過表達，但在胃癌、乳腺癌、胰腺癌中卻明顯低表達［14］本研究通過檢測患者術前血清miR-141 的表達，進一步驗證了其在結直腸癌進展過程中的作用，提示miR-141 在結直腸癌中具有一定的應用價值，可用于結直腸癌手術療效及預后評估中。Sun 等［15］研究顯示，miR-141 在晚期結直腸癌患者血漿中的含量較中晚期患者顯著升高，提示miR-141 額表達可隨著結直腸癌的惡化程度增加而上調。本研究結果也表明，miR-141 與的TNM 分期、分化程度、淋巴結轉移有關，且術前更高血清miR-141 水平的患者的生存預后更差。

綜上所述，術前血清miR-135b、miR-141 水平對結直腸癌根治術患者的術后預后具有良好的評估價值，且是患者術后生存的獨立危險因素，有望成為判斷其預后的潛在生物標志物，且可能是結直腸癌治療的潛在靶點。