子宮頸腫瘤患者HPV-E6/E7 mRNA表達的臨床意義

張一帆 王艷茹 趙琴

宮頸癌是女性常見腫瘤，目前尚未完全闡明宮頸癌發病機制，但多項研究均證實［1-3］，人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是宮頸腫瘤發生的獨立危險因素?；A研究顯示［4］，HPV 基因中包含非編碼區、晚期區及早期區，E6及E7屬HPV 早期區基因，在HPV 病毒轉錄、翻譯過程中發揮重要作用，是HPV 致癌機制中的關鍵點。相關研究顯示［5］，E6及E7編碼的致癌蛋白可與多種因子相互作用，參與宮頸癌的發生及發展。既往研究顯示［6］，HPV-E6/E7 mRNA 的定性分析可用于宮頸腫瘤的鑒別診斷，區分宮頸上皮內瘤變（Cervical intraepithelial neoplasia，CIN）與宮頸癌。本研究中對子宮頸腫瘤患者的HPV-E6/E7 mRNA 進行定量分析，探討其在不同疾病嚴重程度患者中的表達差異，分析其對宮頸腫瘤的診斷價值，為宮頸癌的防治提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年1月至2021年12月在平頂山市婦幼保健院經陰道鏡下宮頸活檢的102 例患者作為研究對象，根據活檢結果，患者分為宮頸癌浸潤組（21例）、CINⅢ級組（33 例）、CINⅡ級組（29 例）及CINⅠ級組（19 例），選擇慢性宮頸炎女性40 例設置為對照組，宮頸癌浸潤組患者年齡26～67 歲，平均年齡（42.48±5.43）歲，經產婦18 例，非經產婦3 例；CINⅢ級組患者年齡28～64 歲，平均年齡（41.42±4.52）歲，經產婦29 例，非經產婦4 例；CINⅡ級組患者年齡24～58 歲，平均年齡（43.52±6.22）歲，經產婦21 例，非經產婦8 例；CINⅠ級組患者年齡22～61 歲，平均年齡（42.96±6.24）歲，經產婦16 例，非經產婦3 例；對照組為慢性宮頸炎患者，年齡24～58 歲，平均年齡（41.63±5.23）歲，經產婦27 例，非經產婦13 例。各組一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

納入標準：CIN 及宮頸癌參考《中國子宮頸癌綜合防治指南》中相關標準［7］，經病理學檢查確診；慢性宮頸炎參考《中華婦產科學》中相關標準［8］，經婦科檢查及白帶檢查確診；所有患者未接受過放療及化療治療；入組前無宮頸癌及CIN 病史；臨床資料完整；經醫院醫學倫理委員會批準。排除標準：子宮頸外科手術史；入組前1 個月內接受過抗菌治療、抗病毒治療者；妊娠期或哺乳期女性；入組前接受過免疫治療者；自身免疫性疾病患者；合并其他部位惡性腫瘤者；合并肝腎功能障礙者。本研究中受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

①宮頸液基薄層細胞學（thinprep cytology test，TCT）檢查：檢查前3 d 內禁止性生活，禁止陰道沖洗及陰道用藥，且檢查避開月經期；將專用宮頸細胞毛刷在宮頸內順時針旋轉6 周左右，采集宮頸管脫落上皮細胞并保存在專用液瓶中，編號后封存；使用全自動細胞制片機（購自湖北孝感闊海醫療科技有限公司，型號：KCT-10）制片，參考TBS分級系統［9］，將TCT 結果分為：鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）；高級別鱗狀CIN（High grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）；低級別鱗狀CIN（Low grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）；意義不明確的非典型鱗狀細胞（Atypical squamous cells of undetermined significances，ASC-US）；不典型鱗狀細胞（Atypical squamous cells：cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion，ASC-H）；無惡性改變及上皮病變（Negative for malignant lesions or intraepithelial lesions，NSIL）。②HPV-E6/E7 mRNA 檢測：將待檢標本放置于離心機（購自美國貝克曼公司，型號：C800），離心半徑13 cm，轉速3 000 r/min，離心15 min后棄上清液，加入細胞裂解液，添加蛋白酶K，分離組蛋白；而后搖勻標本，放置恒溫箱保存2 h，使用捕獲探針捕獲HPV-E6/E7 mRNA，放大信號3 級，進行底物發光反應，觀察發光信號強度，使用冷光檢測儀檢測mRNA 數量，經軟件計算，數量與信號強度呈正比，拷貝數在0 以上時判定為陽性。

1.3 統計學方法

所有統計學資料錄入SPSS 23.0 軟件包，計量資料滿足正態分布，采用（±s）表示，多組間的差異采用單因素方差分析進行比較，多組兩兩間的差異采用SNK-q比較；HPV-E6/E7 mRNA 與患者病變程度的關系使用Pearson相關性分析進行檢驗；使用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析HPV-E6/E7 mRNA 對各疾病的診斷價值；以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組HPV-E6/E7 mRNA 表達水平的比較

HPV-E6/E7 mRNA 表達水平：宮頸癌組＞CINⅢ組＞CINⅡ組＞CINⅠ組＞對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組HPV-E6/E7 mRNA 表達水平的比較（±s）Table 1 Comparison of HPV-E6/E7 mRNA expression levels in each group（±s）

表1 各組HPV-E6/E7 mRNA 表達水平的比較（±s）Table 1 Comparison of HPV-E6/E7 mRNA expression levels in each group（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05，與CINⅠ組比較，bP＜0.05，與CINⅡ組比較，cP＜0.05，與CINⅢ組比較，dP＜0.05。

組別對照組CINⅠ組CINⅡ組CINⅢ組宮頸癌組F 值P 值n HPV-E6/E7 mRNA［lg（copies/mL）］40 19 29 33 21 1.96±0.15 2.95±0.42a 3.68±0.32ab 4.62±0.85abc 5.14±0.95abcd 53.734 0.000

2.2 HPV-E6/E7 mRNA 表達水平與疾病嚴重程度的關系

隨TBS 分級的降低，HPV-E6/E7 mRNA 水平呈降低趨勢，差異有統計學意義（P＜0.05）。HPVE6/E7 mRNA：SCC 組＞HSIL 組＞LSIL 組＞ASC-US組＞ASC-H 組＞NSIL 組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。Pearson 相關性分析結果顯示，HPV-E6/E7 mRNA 表達水平與疾病嚴重程度呈正相關（r=0.525，P=0.007）。見表2。

表2 HPV-E6/E7 mRNA 表達水平與疾病嚴重程度的關系（±s）Table 2 Relationship between HPV-E6/E7 mRNA expression levels and disease severity（±s）

表2 HPV-E6/E7 mRNA 表達水平與疾病嚴重程度的關系（±s）Table 2 Relationship between HPV-E6/E7 mRNA expression levels and disease severity（±s）

注：與SCC 比較，aP＜0.05，與HSIL 比較，bP＜0.05，與LSIL 比較，cP＜0.05，與ASC-US 比較，dP＜0.05，與ASC-H 比較，eP＜0.05。

疾病嚴重程度SCC HSIL LSIL ASC-US ASC-H NSIL F 值P 值n HPV-E6/E7 mRNA［lg（copies/mL）］21 23 21 19 18 40 5.37±1.53 4.78±0.85a 3.79±0.44ab 3.15±0.51abc 2.06±0.24abcd 1.46±0.09abcde 94.952 0.000

2.3 HPV-E6/E7 mRNA 對宮頸腫瘤的診斷價值

HPV-E6/E7 mRNA 鑒別診斷慢性宮頸炎與CIN 的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.747，最佳截斷值為2.35lg（copies/mL），此時診斷敏感度為0.786，特異度為0.846，95%CI為0.652～0.841；HPV-E6/E7 mRNA 鑒別診斷宮頸癌與CIN的AUC 為0.711，此時診斷敏感度為0.609，特異度為0.883，最佳截斷值為4.69lg（copies/mL），95%CI為0.617～0.805（P＜0.05）。見圖1。

圖1 ROC 曲線Figure 1 The ROC curve

3 討論

多項研究顯示［10-12］，由癌前病變發展成為宮頸癌所需時間較長，故開展宮頸癌的早期篩查具有重要意義。臨床上常采用TCT 進行宮頸癌的篩查，具有無創、操作簡便等優勢，但受操作者的涂片操作質量、閱片經驗等影響較大，存在假陰性高等不足。HPV 感染是宮頸癌發生發展的重要危險因素，且與多種宮頸疾病相關，既往研究顯示［13］，HPV 感染能夠輔助篩查宮頸癌，其操作便捷性與TCT 相當。隨著相關研究的不斷深入，目前發現宮頸上皮細胞的持續性HPV 感染才可誘發宮頸癌，聯合進行HPV 篩查具有較高的假陽性率，易造成醫療資源的浪費。故目前尋找更有效的宮頸癌篩查方法成為了臨床探索的重點。

本研究中使用原位雜交技術定量檢測了CIN、慢性宮頸炎及宮頸癌患者的HPV-E6/E7 mRNA 表達情況，結果顯示，宮頸癌組的HPV-E6/E7 mRNA表達水平＞CINⅢ組＞CINⅡ組＞CINⅠ組＞對照組，差異有統計學意義，提示HPV-E6/E7 mRNA 的表達在不同宮頸病變患者中存在差異性，對于判斷宮頸病變具有一定意義。國內莫小亮等研究顯示［14］，HPV的陽性率及E6/E7 mRNA 的表達水平隨著宮頸病變的級別升高而升高，與本研究結果類似。本研究結果顯示，隨TBS 分級的降低，HPV-E6/E7 mRNA水平呈降低趨勢，差異有統計學意義。研究稱［15］，TBS 分級是一種基于陰道/宮頸細胞學的診斷技術，其根據宮頸細胞病變程度進行分級，篩查宮頸癌具有較高特異性。本研究結果提示HPV-E6/E7 mRNA 水平檢測與TBS 分級具有一定相關性，檢測HPV-E6/E7 mRNA 水平能判斷宮頸病變患者的細胞病變程度。本研究結果顯示，SCC 組、HSIL 組、LSIL 組、ASC-US 組、ASC-H 組及NSIL 組的HPVE6/E7 mRNA 表達水平依次降低，且各組間差異均有統計學意義，Pearson 相關性分析結果顯示，HPV-E6/E7 mRNA 表達水平與宮頸疾病嚴重程度呈正相關。本研究結果提示HPV-E6/E7 mRNA 水平隨著宮頸疾病病變程度的加重而升高，基礎研究顯示［16］，HPV 持續感染是宮頸癌的重要病因，與HPV 基因編碼區的早期基因區E6及E7相關，大量HPV 被持續性轉錄成為HPV-E6/E7 mRNA 時，宮頸癌的風險成倍數上升。研究顯示［17］，HPV-E6 基因編碼的E6 蛋白能夠特異性結合癌基因p53的產物，使P53 蛋白快速降解，引起周圍細胞失控，產生類似P53基因突變的效應，具有較強致癌作用。此外有研究證實［18］，E6 蛋白還能降解正常細胞內的PDZ 蛋白，抑制細胞黏附，促進宮頸癌發展。而E7蛋白可與視網膜母細胞瘤蛋白結合，使轉錄因子激活腺病毒E2，造成細胞周圍失控，發揮促進細胞惡性增殖的作用。本研究中進一步分析了HPV-E6/E7 mRNA 水平檢測對宮頸疾病的診斷價值，結果顯示，HPV-E6/E7 mRNA 在鑒別診斷慢性宮頸炎與CIN及宮頸癌與CIN 中均具有一定價值，提示HPV-E6/E7 mRNA 檢測可作為TCT 檢查結果的補充。

綜上所述，HPV-E6/E7 mRNA 在宮頸腫瘤患者中呈高水平表達，且表達水平隨著疾病嚴重程度的增加而增加，檢測HPV-E6/E7 mRNA 的表達可鑒別診斷慢性宮頸炎、CIN 及宮頸癌。