食管癌組織中miR-3651表達(dá)與其IPCL分型及病理分級(jí)的關(guān)系

陳孟君 袁燕文 程樹紅

食管癌（esophageal carcinoma，EC）是世界上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，中國(guó)作每年死于食管癌的人數(shù)位居前列［1］。由于EC 的早期癥狀較不明顯加上大部分居民對(duì)EC 的認(rèn)知情況較差［2］，早期的診斷率較低，EC 患者就醫(yī)時(shí)大多為EC 晚期，錯(cuò)過較好的治療時(shí)機(jī)。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源非編碼小RNA 分子，長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸，能夠參與腫瘤的形成、侵襲和轉(zhuǎn)移過程，miR-3651在EC 組織中表達(dá)存在著差異［3-5］，其在EC 組織中的表達(dá)明顯多于癌旁組織。食管上皮乳頭內(nèi)毛細(xì)血管袢（inteapapillary capillary，IPCL）分型對(duì)于食管早期腫瘤的診斷具有指導(dǎo)意義［6］，目前對(duì)于EC 發(fā)病機(jī)制研究尚且較少，且利用miRNA-3652 對(duì)EC 患者進(jìn)行排查有利于早期篩查EC，能夠提前發(fā)現(xiàn)EC 的幾率大大上升。故本研究旨在探討EC 組織中miR-3651表達(dá)與其IPCL 分型及病理分級(jí)的關(guān)系以及miR-3651表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，為臨床通過miR-3651診斷EC 提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集東莞市人民醫(yī)院2019年1月至2020年12月病理診斷確診并手術(shù)切除EC 患者82 例，分別收集患者的癌旁組織（距離腫瘤邊緣約1～2 cm的組織）以及EC 組織。患者平均年齡（60.02±11.36）歲。男性56 例，女性26 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①參照《食管癌診療指南》［7］制定的EC 診斷標(biāo)準(zhǔn)，確診為EC 的患者；②術(shù)前未接受過其他治療方法，例如化療、放療等；③在本院的臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①同時(shí)患有其他類型的腫瘤；②伴隨有心、腦、腎等重要器官功能障礙；③患者同時(shí)患有嚴(yán)重精神疾病以及精神狀況不佳。本研究已獲得東莞市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者或家屬已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集與處理

手術(shù)中切除EC 組織以及癌旁組織后立即將其放入凍存管并投入術(shù)前準(zhǔn)備好的液氮使其快速冷凍保存。

1.2.2miR-3651檢驗(yàn)

采用實(shí)時(shí)定量PCR 檢驗(yàn)miR-3651表達(dá)。采用Trizol 試劑提取細(xì)胞中總RNA，其中RNA 純度和濃度的檢驗(yàn)采用微量核酸分析儀（杭州優(yōu)米儀器有限公司，型號(hào)：UNano-2000）。隨后參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國(guó)Qiagen 有限公司，貨號(hào)：QA2317）操作說明，混勻后為使其沉淀，將其低速離心20 s，離心參數(shù)25℃，1 600 r/min，離心半徑3 cm，10 min，即可獲得最終轉(zhuǎn)錄成的cDNA。然后以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：37℃，2 min（1 個(gè)循環(huán)）；94℃，15 s 與55℃，45 s（10 個(gè)循環(huán)）；94℃，15 s 與55℃，45 s（30 個(gè)循環(huán)）。miR-3651基因引物序列：CAUAGCCCGGUCGCUGGUACAUGA。采用2-△△Ct法計(jì)算miR-3651的相對(duì)表達(dá)量［8］。由相關(guān)文獻(xiàn)［9］知miR-3651相對(duì)表達(dá)量的最佳截?cái)嘀禐?.528。并根據(jù)該截?cái)嘀祵?duì)miR-3651的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分類，miR-3651的相對(duì)表達(dá)量≥0.528 為高表達(dá)，miR-3651的相對(duì)表達(dá)量＜0.528 為低表達(dá)。

1.2.3 EC 組織的IPCL 分型［10］

采用NBI 加上放大內(nèi)鏡進(jìn)行觀察，識(shí)別病變區(qū)域并根據(jù)IPCL 形態(tài)類型進(jìn)行IPCL 分型。本研究所涉及的IPCL 分型有Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ1型、Ⅴ2型、Ⅴ3A型。

1.2.4 病理分級(jí)［11］

由三名5年以上的工作經(jīng)驗(yàn)的病理科診斷醫(yī)師進(jìn)行病理分級(jí)并達(dá)成一致，將患者按病理分級(jí)進(jìn)行分組，分為低分化組和中高分化組。

1.3 觀察指標(biāo)

對(duì)比EC 組織和癌旁組織中miR-3651表達(dá)量，并分析其與EC 患者的IPCL 分型、病理分級(jí)以及預(yù)后之間的關(guān)系。

1.4 隨訪

隨訪的主要方式是電話隨訪和門診復(fù)查，隨訪截止時(shí)間為2021年12月31日，其中，患者死亡即為隨訪結(jié)束，患者的總生存時(shí)間（Overall Survival，OS）為治療結(jié)束至隨訪結(jié)束或死亡的期間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（±s）表示，用t檢驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì)量，計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，用χ2檢驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì)量。采用Spearman 相關(guān)分析miR-3651表達(dá)與EC 組織IPCL 分型及病理分級(jí)的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行OS 分析以評(píng)估m(xù)iR-3651表達(dá)與OS 之間的關(guān)系，采用Log-rank 檢驗(yàn)單因素的組間差異，多因素分析采用COX 風(fēng)險(xiǎn)模型分析EC 預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EC 組織與癌旁組織miR-3651 表達(dá)比較

EC 組織中miR-3651相對(duì)表達(dá)量（2.083±0.813）明顯高于癌旁組織（0.304±0.265），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.839、P＜0.001）。見圖1。

圖1 食管癌在蘇木精-伊紅染色法下的病理圖片（電鏡觀察圖，×200）Figure 1 Pathological pictures of esophageal cancer（electron microscope observation，×200）

2.2 EC 組織各IPCL 分型以及病理分級(jí)之間miR-3651 表達(dá)比較

各IPCL 分型之間EC 組織的miR-3651相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)t檢驗(yàn)分析，Ⅴ1型、Ⅴ2型、Ⅴ3A型的miR-3651相對(duì)表達(dá)量明顯高于Ⅲ型的miR-3651相對(duì)表達(dá)量，且Ⅴ3A型的miR-3651相對(duì)表達(dá)量明顯高于Ⅴ1型的miR-3651相對(duì)表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各病理分級(jí)之間的miR-3651相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 EC 組織miR-3651 表達(dá)與患者EC 組織的IPCL 分型及病理分級(jí)的關(guān)系（±s）Table 1 The relationship between the expression of miR-3651 in EC tissue and the IPCL type and pathological grade of esophageal cancer tissue in patients（±s）

表1 EC 組織miR-3651 表達(dá)與患者EC 組織的IPCL 分型及病理分級(jí)的關(guān)系（±s）Table 1 The relationship between the expression of miR-3651 in EC tissue and the IPCL type and pathological grade of esophageal cancer tissue in patients（±s）

注：與Ⅲ型相比，aP＜0.05；與V1 型比較，bP＜0.05。

臨床病理特征IPCL 分型Ⅲ型Ⅳ型Ⅴ1型Ⅴ2型Ⅴ3A型病理分級(jí)低分化中-高分化n 81 2 miR-3651 相對(duì)表達(dá)量F/t 值P 值26 19 17 3.002±1.096 3.657±1.362 4.399±0.960a 4.864±0.877a 5.036±0.804ab 8.411＜0.001 39 43 3.367±0.550 5.325±0.561 15.931＜0.001

2.3 EC 組織miR-3651 表達(dá)與患者EC 組織的IPCL 分型及病理分級(jí)的相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman 相關(guān)分析，食道癌患者癌組織中miR-3651表達(dá)水平與患者EC 組織的IPCL 分型（r=0.306，P=0.005）及病理分級(jí)（r=0.332，P＜0.001）呈正相關(guān)。

2.4 EC 組織miR-3651 表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

miR-3651的低表達(dá)和高表達(dá)在年齡、病理分型、TNM 分期、IPCL 分型以及病理分級(jí)方面比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而兩組在性別、體重指數(shù)方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 EC 組織miR-3651 表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系［n（%），（±s）］Table 2 Relationship between miR-3651 expression in EC tissues and clinicopathological characteristics of patients［n（%），（±s）］

表2 EC 組織miR-3651 表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系［n（%），（±s）］Table 2 Relationship between miR-3651 expression in EC tissues and clinicopathological characteristics of patients［n（%），（±s）］

臨床病理特征miR-3651高表達(dá)（n=43）低表達(dá)（n=39）χ2/t 值P 值性別男女30（69.77）13（30.23）26（66.67）13（33.33）0.786 0.074年齡≥60＜60體重指數(shù)［kg*m-2］病理分型上皮內(nèi)瘤變或原位癌早期食管癌浸潤(rùn)性食管癌TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期Ⅲ、Ⅳ期IPCL 分型Ⅲ型Ⅳ型Ⅴ1型Ⅴ2型Ⅴ3A型病理分級(jí)低分化中-高分化35（81.40）8（18.60）21.04±1.33 23（58.97）16（32.03）21.43±1.26 4.069 0.044 1.360 0.178 16（37.22）12（27.91）15（34.88）29（74.36）7（17.95）3（7.69）12.907 0.002 22（51.16）21（48.84）27（69.23）12（30.77）6.411 0.011 3（37.50）6（50.00）16（69.23）11（78.95）12（88.24）5（62.50）6（50.00）8（30.77）4（21.05）2（11.76）9.635 0.047 19（48.72）27（62.79）20（51.28）16（37.21）5.826 0.016

2.5 影響EC 患者預(yù)后的Cox 回歸分析

截至2021年12月，共隨訪12 個(gè)月，隨訪期間死亡15 例。miR-3651高表達(dá)者與低表達(dá)者術(shù)后一年總生存率分別為74.42%（32/43）、92.31%（36/39），miR-3651高表達(dá)者術(shù)后1年總生存率低于miR-3651低表達(dá)者（χ2=4.623，P＜0.05）。見圖2。將EC 患者預(yù)后情況設(shè)為因變量，將單因素分析中存在顯著性差異的因素設(shè)為自變量。賦值情況見表3。Cox 回歸分析結(jié)果顯示，浸潤(rùn)性食管癌、IPCL 分型Ⅴ3A型、病理分級(jí)中-高分化以及miR-3651表達(dá)≥0.528 為EC 患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表4。

表3 賦值表Table 3 Assignment table

圖2 生存曲線Figure 2 Survival curve

3 討論

EC 在全球范圍內(nèi)的消化道惡性腫瘤中，屬于發(fā)病率極高的腫瘤。早期EC 患者經(jīng)治療后5年生存率可達(dá)95%［12］，并且腫瘤的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，單純依靠早期篩查中使用的內(nèi)鏡對(duì)EC 腫瘤組織的形態(tài)進(jìn)行觀察并診斷十分容易出現(xiàn)漏診或誤診的情況。因此，找到能夠在早期診斷出EC 的指標(biāo)是十分必要的。

據(jù)有關(guān)研究表示miR-3651相對(duì)表達(dá)量在EC組織和癌旁組織間差異顯著，能夠作為一項(xiàng)觀察指標(biāo)有助于臨床早期篩查EC。本研究研究結(jié)果表明：EC 組織中miR-3651相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織中；各IPCL 分型之間及病理分級(jí)EC 組織的miR-3651相對(duì)表達(dá)量比較有區(qū)別；食道癌患者癌組織中miR-3651表達(dá)水平與患者EC 組織的IPCL 分型及病理分級(jí)呈正相關(guān)。因此，我們可以通過這種差異來鑒別組織是否為食管癌組織從而提高食管癌的診斷的準(zhǔn)確度。據(jù)有關(guān)研究表示［8］，miR-3651能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9（Matrix metallopeptidase-9，MMP-9）和細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）的表達(dá)，其中MMP-9 通過調(diào)節(jié)腫瘤的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）以促進(jìn)腫瘤的侵襲遷移［13］，ICAM-1 可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移作用［14］，因此miR-3651能夠通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移，加速癌癥范圍的擴(kuò)散，從而加重EC 病情。

隨訪期間miR-3651高表達(dá)者術(shù)后1年總生存率較高，并且病理分型為浸潤(rùn)性食管癌、IPCL 分型Ⅴ3A型、病理分級(jí)中-高分化以及miR-3651表達(dá)≥0.528 為EC 患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。具體原因如下：在手術(shù)中，由于浸潤(rùn)性食管癌的腫瘤細(xì)胞的結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，很有可能會(huì)導(dǎo)致手術(shù)中腫瘤組織切除不干凈，影響預(yù)后甚至可能導(dǎo)致復(fù)發(fā)；據(jù)有關(guān)研究報(bào)道［10］，IPCL 分型對(duì)浸潤(rùn)深度診斷的準(zhǔn)確度高達(dá)70.83%，因此IPCL 分型的結(jié)果能夠較為準(zhǔn)確地診斷出病情，EC 的病理分級(jí)是按照其分化程度劃分的，分化程度越低的EC 其惡性程度越差，其腫瘤就具有越豐富的新生血管［15］；而IPCL 分型以及病理分級(jí)是按照病情嚴(yán)重程度進(jìn)行劃分的，故病情越嚴(yán)重的患者其預(yù)后越差；miR-3651的表達(dá)譜可以作為一種重要的生物標(biāo)志物去評(píng)估癌癥患者的腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后的過程。由于miR-3651可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移，因此手術(shù)中有較大的可能性未能完全切除腫瘤組織，術(shù)后極易出現(xiàn)預(yù)后不良以及復(fù)發(fā)的情況。

綜上所述，miR-3651與EC 組織的IPCL 分型以及病理分級(jí)具有一定的關(guān)系，miR-3651表達(dá)水平檢驗(yàn)可以作為一項(xiàng)客觀指標(biāo)協(xié)助臨床醫(yī)生對(duì)EC 嚴(yán)重程度以及預(yù)后是否良好進(jìn)行診斷，臨床參考價(jià)值較高。