臍血來源NK細胞對肝腫瘤生長抑制作用

吳炳義 李娟華 李燁 張蘭蘭 朱偉 陳瓊，3★ 呂成偉，3★

肝癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是我國常見的惡性腫瘤之一，致死率高［1］。對于晚期無法手術的HCC 患者，一線藥物如索拉菲尼、瑞戈非尼等小分子激酶抑制劑能一定程度提高患者總生存率，但不能有效抑制肝癌進展、改善整體預后［2-3］。因此，亟需新的治療手段提高肝癌患者的生存質量。免疫療法的出現為此開辟了新路。

自然殺傷細胞（natural killer cell，NK cell）作為機體的固有免疫，是抵御病毒感染和腫瘤細胞的第一道防線。NK 細胞l 通過細胞毒效應可殺傷主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex，MHC）低表達的腫瘤細胞［4］。隨著相關研究不斷探索，其在治療多種腫瘤疾病方面表現出良好的前景［5］，可作為腫瘤過繼性免疫治療的重要候選細胞［6］。目前，用于臨床研究的NK 細胞主要來源于外周血、臍血、誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）等［7-8］。研究表明，臍血中NK 前體細胞含量高于成人外周血，且安全性高于iPSC 來源［9-10］。因此，本研究利用臍血來源NK細胞，在細胞和動物水平驗證其用于肝癌治療的安全性和有效性，為下一步開展NK 細胞治療肝癌的臨床研究提供前瞻性研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

淋巴細胞無血清培養基X-ViVo15（Lonza 公司，04-418Q，1L）；NK 細胞刺激劑、淋巴細胞營養添加劑（HANK 公司，A2005001-5，5 mL；PC200903，1.5 mL）；0.9%氯化鈉注釋液（Baxter）；人淋巴細胞分離液（灝洋，HY2015L，200 mL）；培養瓶（Thermo 公司）；細胞計數板（Invitrogen 公司）；臺盼藍染色液（Sigma 公司）；乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）Assy kit（碧云天，C0016）；DMEM 細胞培養基、1640 細胞培養基、1×PBS（均來自Gibco）；流式抗體anti-human CD3（BD Pharmingen 公司，563219，100test）、anti-human CD56（BD Pharmingen，555518，100test）。

1.2 實驗儀器設備

生物安全柜（ECSO 公司，AC2-6S1）、CO2培養箱（ESCO 公司，CLM-170B-8-NF）；細胞計數儀（Thermo 公司，CountessⅡ）、離心機（Thermo 公司，ST40）；流式細胞儀（CYTEK 公司，NL3000）；低溫保存箱4℃～-20℃（海爾，BCD-216WMPT）；倒置顯微鏡（Leica 公司，DMI 1）。

1.3 臍血來源

南方醫科大學南方醫院增城分院婦產科，采集前取得產婦知情同意并簽署《知情同意書》。采集40 mL 臍血于4℃保存運輸，并在采集后12 h 內完成UCBMC 分離。本研究經院醫學倫理委員會批準通過。

1.4 試驗方法

1.4.1 NK 培養與擴增

將臍血按600×g（離心半徑209 mm）離心15 min 后小心吸出血漿，56℃水浴滅活30 min；以淋巴細胞分離液離心法600×g 離心15 min 收集白膜層（UCBMC），并用生理鹽水洗滌2 次，細胞計數。用HANK 細胞培養液重懸細胞后，加入細胞刺激劑于T75 細胞瓶中混合培養（37℃，5%CO2），21 天后收集細胞。培養期間補加細胞培養液，并分別于第5、8、14、21 天進行拍照和計數。

1.4.2 NK 細胞數量與純度檢測

以臺盼藍染色法計數活細胞及總細胞數。取第14 天和21 天細胞進行流式分析：加入500 μL流式緩沖液洗滌，500×g 離心（離心半徑209 mm）5 min，去上清，加50 μL 流式緩沖液重懸。樣品管加CD3 流式抗體1.25 μL 和CD56 流式抗體5 μL（空白管不加染料），4℃避光孵育15 min；染色后加500 μL 流式緩沖液洗滌1 次，500×g 離心5 min 后去上清，加300 μL 流式緩沖液重懸細胞，上機檢測。

1.4.3 NK 細胞殺傷活性

收集培養21 天的NK 細胞作為效應細胞；選取癌細胞系：鼻咽癌細胞C666-1、肝癌細胞HepG2、宮頸癌細胞C33a 和SHA、結腸癌細胞Caco2 以及胃癌細胞MNK45 作為靶細胞，調整濃度至5×105/mL；分別設置①陰性對照組：靶細胞；②陽性對照組：靶細胞，培養結束前6 h 加入裂解液釋放LDH。③實驗組：靶細胞+效應細胞，設置效靶比2∶1，5∶1和10∶1；每組3 個復孔，置于CO2培養箱中培養24 h。分別取每孔上清進行LDH 活性檢測。按以下公式計算：NK 細胞殺傷活性（%）=［（實驗組LDH 值-陰性對照孔LDH 值）/（陽性對照孔LDH 值-陰性對照孔LDH 值）］×100%。

1.4.4 NK 細胞治療HCC

取20 只SPF 級M-NSG 小鼠（17～20 g）（購于南方模式小鼠，許可證號：SCXK（滬）2017-0010），飼養一周以適應新環境，并隨機分成4 組。包括NK 靜注治療組和靜脈注射對照組：尾靜脈注射2.0×107個NK 細胞或同體積生理鹽水；NK 瘤內治療組以及瘤內注射對照組：瘤內注射5.0×106個NK細胞或同體積生理鹽水。分別于第5、10、15、20、25、30、35 天檢測腫瘤體積大小。第40 天取腫瘤組織稱重并拍照。

1.4.5 小鼠眼眶外周血流式分析

分別取小鼠尾靜脈對照組、NK 靜注治療組第37 天眼眶外周血，加入1 mL 1×紅細胞裂解液，至紅細胞裂解充分，加入流式抗體孵育液，室溫避光孵育20 min，1×PBS 洗滌，并重懸后上機檢測。

1.4.6 免疫組化分析組織標本中NK 細胞標志蛋白CD56 的表達量

取NK 靜注治療組和對照組第40 天的小鼠腫瘤、心、腦、肝組織，經甲醛固定48 h 后，組織脫水、石蠟包埋并切片。切片經脫蠟后進行抗原修復，并封閉15 min，1×PBS 浸洗后加anti-mouse CD56 一抗稀釋液，4℃孵育過夜，1×PBS 代替一抗作陰性對照；加辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液（1∶100稀釋）并室溫避光孵育45 min，1×PBS 浸洗，DAB顯色劑顯色，蘇木素染色后分化，返藍，脫水、透明、封片、鏡檢。

1.5 統計學分析

采用GraphPad Prism 8.0 軟件作圖和SPSS 20.0 軟件統計進行數據分析；以Shapiro-Wilk 法檢驗統計資料的正態性，符合正態分布與方差齊性的資料采用獨立樣本t檢驗，不符合正態分布與方差齊性的采用非參數MannWhitney U 檢驗；以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NK 細胞形態

本研究培養中的NK 細胞形態表現為懸浮生長，密集形態為成簇成團，單個細胞為圓形細胞懸浮形態。見圖1。

圖1 NK 細胞培養過程在倒置顯微鏡下觀察細胞形態Figure 1 NK cellular morphology during the cell culture

2.2 NK 細胞的增殖與純度檢測

UCBMCs 接種量為0.25×108，培養前5 天NK細胞生長較慢。之后細胞增殖速度加快，培養至21 天時，細胞數量達13.78×108。見圖2。第14 和21 天細胞流式分析，結果顯示CD3-CD56+細胞比例達95%以上。見圖3。

圖2 NK 細胞誘導培養增殖曲線Figure 2 Proliferation curve of NK cells inducing culture

圖3 NK 細胞純度與流式分析Figure 3 The purity of NK cells was identified by flow cytometry

2.3 NK 細胞對腫瘤細胞殺傷活性

NK 細胞對癌細胞株殺傷效果均呈現濃度依賴性，對癌細胞的殺傷活性依次為HepG2＞SHA＞Caco2＞C33a＞C666-1＞MNK45。見圖4。

圖4 NK 細胞對多種癌細胞株的殺傷活性（%）Figure 4 Killing activity of NK cells to different cancer cells（%）

2.4 NK 細胞對腫瘤組織生長的影響

尾靜脈/瘤內注射NK 細胞組的小鼠體積大小Day15 內與對照組無明顯差別；之后，NK 治療組與對照組相比，腫瘤體積呈下降趨勢。NK 細胞治療35 天后，尾靜脈組腫瘤大小顯著下降（P＜0.01）。見圖5A。與對照組相比，Day40 NK 注射組腫瘤組織重量與大小均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。見圖5B、5C。

圖5 NK 細胞對肝腫瘤的抑制作用Figure 5 Inhibiting effect of NK cells to hepatoma

2.5 NK 細胞靜脈移植安全性

檢測結果顯示，尾靜脈對照組和NK 靜注治療組小鼠第37 天外周血以及各組織中無人源NK 細胞殘留。見圖6。

圖6 NK 細胞移植體內殘留情況分析Figure 6 Analysis of the residual NK cells transplanting in vivo

3 討論

NK 細胞在肝臟中高度富集，占肝內淋巴細胞的30%～50%，比外周血中占比高出2～5 倍［11］。同時，肝臟中NK 細胞毒性和產生細胞因子的能力均高于外周血NK 細胞，推測其在肝臟免疫監測中發揮重要功能［12］。而肝癌患者外周血和腫瘤浸潤部位NK 細胞的數量明顯減少，且NK 細胞功能嚴重受損，患者經治療后NK 細胞活性可得到恢復［13］。由此推測NK 細胞在肝癌患者免疫防御中起著重要的作用，肝癌細胞可能是NK 細胞免疫治療的重要靶標。本研究通過肝癌裸鼠模型證明了異種移植NK 細胞對肝腫瘤具有顯著殺傷作用。進一步的研究表明移植NK 細胞在小鼠體內參與正常代謝，不具有成瘤性，說明NK 細胞移植的安全性。

研究表明NK 細胞的抗腫瘤作用機制主要包括①被激活的細胞釋放受體與腫瘤細胞表面的抗體相結合發揮細胞毒性作用，通過釋放穿孔素和顆粒酶或通過死亡受體直接殺死癌細胞［14］；②分泌細胞因子和趨化因子，如GM-CSF，IL10，IL2，CCL3，CCL4，CCL5，IFN-γ，TNF-α 等，調節免疫細胞間接殺死病變細胞［15］。NK 細胞具有非MHC 限制的廣譜抗腫瘤作用，對幾乎所有常見類型的癌細胞都有殺傷作用［6］。本研究結果表明，UCBMC經誘導擴增激活的NK 細胞對鼻咽癌、肝癌、宮頸癌，結腸癌以及胃癌細胞均具有殺傷作用，證實了臍血源NK 細胞的廣譜抗腫瘤作用。

已有臨床研究證實了同種異體NK 細胞治療肝癌有很好的安全性和有效性，患者臨床安全性良好、短期生活質量得到提高、臨床癥狀得到改善［16-17］。上述結果均與本研究動物實驗結果吻合，說明NK 細胞在肝癌治療中具有一定的臨床應用價值。但本研究選用臍血來源NK 細胞，其優勢在于NK 細胞培養體系穩定，擴增得到的NK 細胞增殖倍數、純度均符合行業的臨床應用標準，批間差異小于外周血來源擴增的NK 細胞（數據未在本研究顯示）。因此，本研究體外擴增制備的臍血來源NK 細胞有望成為治療肝癌的有效手段，為下一步開展臨床研究提供前期研究基礎。盡管如此，隨著NK 細胞在體內的耗竭與功能下降，其抗肝癌治療效果隨著腫瘤進展可能非常有限［18］。因此，采用抗肝癌藥物聯合NK 細胞治療的方案顯得十分必要。本研究下一步將評估肝癌一線藥物聯合NK 細胞的治療有效性與安全性，為推動肝癌治療提供研究數據。

綜上所述，本研究建立了從臍血分離單個核細胞、誘導擴增培養NK 細胞的穩定實驗技術，并通過多種腫瘤細胞的殺傷試驗證明所培養的NK細胞殺傷作用良好。進一步的肝癌動物模型實驗結果表明本研究制備的臍血NK 細胞在動物水平用于肝癌治療的有效性和安全性良好。