建立一種高靈敏的HBV核酸定量檢測方法

李卓 于海濤 高娟 黃燕

全球范圍內約有2.5 億人感染慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）［1］。感染HBV 后，約有15～40%會進展為肝硬化、肝衰竭甚至肝癌［1-2］，每年導致近100 萬人死亡。我國人群HBV 攜帶率約為10%，有超過1 億的無癥狀病毒攜帶者以及2 000 多萬慢性乙肝患者［3］，給社會經濟和醫療帶來巨大負擔。

準確診斷聯合預防策略，對于指導患者管理以及控制HBV 向易感人群的傳播尤為重要，HBV核酸定量檢測是評價療效和預后最常用的方法［4-6］。目前，國內已有很多商品化的HBV 核酸檢測試劑盒，但由于不同試劑盒往往針對病毒核酸不同位點，檢測性能差別較大，靈敏度和特異性難以滿足臨床需求［7］。本研究擬建立一種靈敏度高、特異性強、操作簡便、更適用于臨床的HBV 核酸定量檢測方法，全面評估該方法的靈敏度、特異性和重復性，同時與另外一種普遍使用的HBV 核酸檢測試劑盒進行比較，從而評價該方法的臨床性能。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2020年2月至2021年6月來自中南大學湘雅醫院、浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院和西安醫學院第一附屬醫院，共計631 例樣本，包括血漿60例，血清571 例（其中60 例與血漿樣本為同一來源）。所有參與單位均通過醫學倫理部門審核同意。

1.2 儀器與試劑

采用西安天隆科技有限公司生產的全自動核酸提取儀及其配套的核酸提取或純化試劑盒（批號：PANA9600S）進行核酸提?。徊捎肁 公司生產的“乙型肝炎病毒核酸測定試劑盒（PCR-熒光探針法）”（批號：2019008）作為對照試劑；B 公司生產的“乙型肝炎病毒（HBV）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）”（批號：C0010481902）作為復核試劑；qPCR 預混液、Taq DNA 聚合酶及UNG 酶，均來自西安天隆科技有限公司（批號：P1662001001）；實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司（Thermo Fisher，AB1 7500）。

1.3 方法

1.3.1 核酸提取及濃度測定

所有采集的血清和血漿樣本，采用全自動核酸提取儀及其配套試劑盒進行DNA 提取，并用紫外分光光度計檢測DNA 濃度和質量。

1.3.2 HBV 核酸定量檢測方法

①引物及探針的設計：選用HBV 病毒保守基因片段設計引物及特異TaqMan 探針，并利用Primer Express 軟件設計一段人工合成的非競爭性序列為內標模板，設計引物探針，內標探針選用VIC 通道熒光標記；②TaqMan 實時熒光PCR 進行HBV 核酸定量檢測：配制PCR 反應液，包括qPCR預混液，4.2 μL 引物探針混合液，0.4 μL Taq DNA聚合酶，0.4 μL UNG 酶。向反應液中分別加入20 μL HBV 質控品或定量標準品，以及樣品DNA。PCR 擴增程序為：50℃2 min，95℃3 min，隨后94℃15 s，55℃15 s，最后72℃15 s，共5 個循環；隨后94℃15 s，60℃30 s，共40 個循環。目標基因FAM 通道的Ct 值＜35，內標VIC 通道的Ct 值＜40，則判斷該樣本為HBV 陽性，否則為陰性。HBV 強陽性質控品Ct 值應小于20，HBV 臨界陽性質控品Ct 值應在25～30 之間，HBV 陰性質控品Ct 值無數據且內標Ct 值＜40。

1.3.3 靈敏度分析

采用滅活的人源HBV 陰性血清和血漿樣本，將HBV 核酸國家標準品（300022-201601）血清及血漿樣本稀釋，制備K1（20 IU/mL）、K2（15 IU/mL）、K3（10 IU/mL）、K4（5 IU/ mL）、K5（2.5 IU/ mL）樣本，對樣品中的HBV 進行定量檢測，每份樣本重復檢測24 次，分三天進行。計算檢出率和Ct 值的變異系數（CV，%）。

1.3.4 重復性分析

采用滅活的人HBV 陰性血漿樣本，將商品化的HBV 血漿（包含HBV A～H 型別）按型別分別稀釋，制備成強陽性樣本（5 log IU/mL）、弱陽性樣本（2 log IU/mL）、臨界陽性樣本（1.3 log IU/mL）。所有樣本在不同時間重復檢測，每個樣本共重復20 次，計算檢出率及Ct 值的變異系數（CV，%）。

1.3.5 特異性分析

采用干擾物添加方法進行特異性分析。①收集可能與HBV 存在交叉的15 種臨床樣本，包括丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人類皰疹病毒Ⅳ型、人巨細胞病毒、甲型肝炎病毒、單純皰疹病毒Ⅰ型、單純皰疹病毒Ⅱ型、結核分枝桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、人類免疫缺陷病毒、梅毒、甲型流感病毒、痤瘡丙酸桿菌和人類皰疹病毒Ⅵ型等樣本，經確認為HBV 陰性。細菌感染的水平為106cfu/mL 或更高，病毒為105pfu/mL 或更高。所有樣本重復檢測3 次；②內源性干擾：采用正常血清和含有30 mg/mL 游離血紅蛋白、60 mg/mL 甘油三酯、0.6 mg/mL 膽紅素、40 mg/mLIgG 及80 IU/mL類風濕因子的血清樣品，分別制備HBV 終濃度為30 IU/mL 的血清，重復檢測5 次；③外源性干擾：針對HBV 常用治療藥物，采用正常的血漿和含有300 U/mL 干擾素α，4.5 μg/mL 拉米夫定，75 ng/mL阿德福韋酯，15 μg/mL 替比夫定，50 ng/mL 恩替卡韋的血漿，制備至終濃度30 IU/mL，重復3 次。

1.3.6 乙型肝炎病毒核酸定量檢測的對照分析及結果復核

對照試劑采用A 公司生產的HBV 核酸測定試劑盒（檢測下限為500 copies/mL），所有血清和血漿樣本采用本文提出的HBV 核酸定量檢測方法和對照試劑盒同時進行檢測，結果不一致的樣本采用B 公司生產的HBV 核酸檢測試劑盒（檢測下限為5 IU/mL）進行復核檢測。

1.3.7 統計學分析

采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析；計量資料用（±s）表示，計數資料以（%）表示；采用Passing-Bablok 回歸分析進行一致性評價和Kappa統計分析，評估HBV 核酸定量檢測方法的臨床性能；以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HBV 核酸定量檢測方法的靈敏度及重復性評估

HBV 核酸定量檢測方法對標準品中5 IU/mL的血清（圖1A）和血漿樣本（圖1B）的檢出率均為100%，檢測CV≤5%，且與理論值濃度偏差≤0.5，重復性檢測結果，強陽性樣本、弱陽性樣本和臨界陽性樣本的陽性檢出率均為100%，且所有樣本的Ct值的CV 值均≤5%。見表1。

表1 HBV 分型檢測結果Table 1 Results of the HBV subtyping test

圖1 HBV DNA 定量檢測方法對血清和血漿樣本的檢測靈敏度分析結果Figure 1 Results of the sensitivity of the HBV DNA quantification method for serum and plasma samples

2.2 HBV 核酸定量檢測方法的特異性評估

15 份感染其他病原體的樣本結果均為陰性，無交叉反應。30 mg/mL 游離血紅蛋白、60 mg/mL甘油三酯、0.6 mg/mL 膽紅素、40 mg/mL 總G 型免疫蛋白（IgG）及800 IU/mL 的類風濕因子的Ct 值與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2A。300 U/mL IFNα，4.5 μg/mL 拉米夫定，75 ng/mL 阿德福韋酯，15 μg/mL 替比夫定，50 ng/mL恩替卡韋的Ct 值與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2B。

圖2 HBV DNA 定量檢測方法與不同干擾物的交叉反應結果Figure 2 Results of the cross-reaction of HBV DNA quantitative method with different distractors

2.3 HBV 核酸定量檢測方法與對照試劑盒定性分析的一致性比較

571 例樣本中有6 例血清樣本在使用本研究建立的HBV 核酸定量檢測方法與對照試劑盒時檢測結果不一致，本法檢測結果判定為陽性，對照試劑盒檢測結果為陰性，采用復核試劑盒進行檢測，結果6 例樣本均為陽性，與本文建立的方法檢測結果一致。見表2。

60 例血漿樣本中1 例檢測結果在使用本研究建立的HBV 核酸定量檢測方法時為陰性，對照試劑盒檢測為陽性，結果不一致（表2-樣本編號：X245），經復核為陰性，與本文建立的方法檢測結果一致。

表2 檢測結果不一致樣本的復核檢測Table 2 Retesting of samples with inconsistent results

2.4 HBV 核酸定量檢測方法與對照試劑盒定量分析的一致性比較

血漿樣本的檢測差異均值為0.021 2。見圖3A。血清樣本的檢測差異均值為-0.011 3。見圖3B。針對血清和血漿樣本，對照試劑盒與本文建立的HBV 定量檢測方法（考核試劑）的一致性限的范圍分別為（-0.312 8～0.355 2）和（-0.337 3～0.314 6），在臨床認可標準范圍內（-0.4～0.4）；回歸分析顯示，兩者的線性度無明顯偏差；但兩種樣本的檢測結果有統計學意義（P均＜0.05）。

圖3 HBV 核酸定量檢測方法與對照試劑盒定量分析的一致性比較Figure 3 Comparison of agreement between the HBV quantitative methods and control kits

3 討論

HBV DNA 載量通常被認為是衡量病毒復制情況的“金標準”，與臨床上乙肝的疾病活動度和傳染性密切相關［8-10］。歐洲肝病研究學會指南指出HBV DNA 載量應盡可能控制在10～15 IU/mL，并建議其最低檢測限為30 IU/mL［11］。目前，我國的HBV DNA 檢測多為基于煮沸法進行PCR檢測，耗時較長，靈敏度低，檢測限普遍為500～1 000 IU/mL，因此臨床普遍采用進口的高敏檢測試劑盒，雖然重復性好但價格昂貴。本文建立了一種基于Taqman 探針的定量PCR 檢測方法，具有以下優勢：一、檢測通量大，僅需2 h 可同時檢測94份標本；二、靈敏度高，重復性好，能有效區分不同亞型和不同陽性程度的HBV 樣本；三、全程閉管，可有效避免污染；四、特異性高，與干擾物無交叉反應。且采用雙熒光通道，檢測結果直觀，便于臨床推廣。

為進一步評價其臨床性能，本研究還與目前市場占有率較高的常規HBV DNA 檢測試劑盒進行了比較，結果發現：一、該方法靈敏度高，檢測限低至5 IU/mL，對HBVA-H 型強陽性、弱陽性和臨界陽性樣本的檢出率均為100%；二、特異性高，可能存在交叉反應的15種病原體對檢測結果均無影響；三、該方法與對照試劑的一致性分析比較發現存在個別樣本檢測結果不一致，后經過復核試劑確認和本法結果一致。其中，結果不一致的6例血清樣本均為低濃度樣本，因為不同檢測方法存在檢測靈敏度的差異，可能是導致對照試劑出現假陰性結果的原因；另有1例血漿樣本，考核試劑檢測為陰性，而對照試劑則為陽性，經復核結果與考核試劑一致，表明本文建立方法準確性高，具有較好的臨床應用價值。

綜上，本研究開發的HBV 核酸定量檢測方法具有較高的靈敏度和特異性，能夠有效區分不同的病毒亞型，性能符合臨床要求，有望為乙肝的臨床診斷提供一種新的實驗室檢測方法和參考依據。