超分子萃取技術測定滴眼液中的4種防腐劑*

粟 雯，陳志良，劉梯樓

(1 邵陽學院藥學院，湖南 邵陽 422000；2 湘西南中藥開發利用湖南省工程研究中心，湖南 邵陽 422000)

對羥基苯甲酸酯又名尼泊金酯，因其抗菌性強，無臭無味，毒性低，刺激性小，被廣泛應用于液體制劑中。目前使用較多的是對羥基苯甲酸甲酯(methylparaben，MP)、對羥基苯甲酸乙酯(ethylparaben，EP)、對羥基苯甲酸丙酯(propylparaben，PP)和對羥基苯甲酸丁酯(butylparaben，BP)[1-2]。而滴眼液是眼科常用的液體治療制劑，通常需要加入微量的防腐劑，以提高藥物的穩定性，并防止病原微生物的污染。但是滴眼液的不當使用可能會損傷眼表, 進而引發視功能的障礙, 而滴眼液中防腐劑的過量添加就是導致這些損害的重要原因[3-4]。

由于滴眼液中防腐劑含量較低，目前，前處理方法主要包括固相萃取[5-6]，液液萃取[7]，超聲萃取[8-9]等，但是這些方法一般所需溶劑用量高，分析時間長，萃取效率較低，此外大量有機溶劑的使用也會對實驗環境和相關人員產生不利的影響。因此，發展簡單環保，綠色高效的前處理技術是很有必要的。超分子溶劑(supramolecular solvent，SUPRAS) 萃取技術一般是由兩種或兩種以上兩親性分子依靠非共價作用結合在一起，有組織的自發形成具有納米結構的膠束聚集體。其由西班牙學者 Rubio等[10-11]提出，通常由長鏈烷基醇或烷基酸與四氫呋喃(THF)和水混合，形成比水密度輕的反相膠束。由于其具有高濃度的兩親化合物，并且簡單環保，萃取高效，被廣泛應用于萃取不同極性的化合物[12]。

本研究以THF為分散劑，壬醇為萃取劑，在水中自發組裝形成超分子溶劑，對滴眼液進行液液微萃取，結合高效液相色譜法，建立了滴眼液中4種對羥基苯甲酸酯類物質(MP、EP、PP、BP)的分析方法。本方法簡單環保，快速高效，回收率高，可適用于羥苯酯類物質的同時分析測定。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

E2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；H-1850臺式高速離心機，湖南湘儀；QL-901渦旋混合器，海門其林貝儀爾儀器制造有限公司；BSA124S電子分析天平，德國賽多利斯。

甲醇，德國默克公司；四氫呋喃，Adamas；對羥基苯甲酸酯類標準品(對羥基苯甲酸甲酯，對羥基苯甲酸乙酯，對羥基苯甲酸丙酯，對羥基苯甲酸丁酯，Dr.E)；壬醇，Adamas；小樂敦復方?；撬岬窝垡?，曼秀雷敦中國藥業有限公司：批號21K291；樂敦清復方氯化鈉滴眼液，曼秀雷敦中國藥業有限公司：批號21E051；珍視明四味珍層冰硼滴眼液，江西珍視明藥業有限公司：批號210209；屈臣氏蒸餾水。

1.2 標準溶液的配制

購買的為溶于甲醇的1000 μg/mL的對羥基苯甲酸酯類標準儲備溶液，分別取4種物質標準儲備溶液，將其混合均勻成100 μg/mL的混合物質標準儲備液，置于4 ℃冰箱內保存待用，使用時，用甲醇逐級稀釋成一系列標準濃度的質量溶液，現用現配。

1.3 超分子溶劑的制備

取1 mL THF和300 μL壬醇迅速注入10 mL的離心管中，加入4.7 mL蒸餾水(保持溶劑總體積為6 mL)，渦旋30 s,混合均勻后以3000 r/min的速度離心5 min，用微量注射器移取上層有機相至玻璃瓶中，即得超分子溶劑，于4 ℃冰箱中密封保存。

1.4 樣品處理

移取滴眼液5 mL于離心管中，加入2 mL的超分子溶劑，渦旋振蕩3 min后，以3000 r/min的速度離心5 min，移取上層液體，用微孔濾膜(0.22 μm)過濾后，待高效液相色譜測定。

1.5 色譜條件

色譜柱為Servo-PT C18120A(250 mm×4.6 mm×5 μm)；柱溫25 ℃；進樣量10 μL；流動相為甲醇(A): 水溶液(B)；梯度洗脫程序：0～2.0 min，5%～20% A；2.0～4.0 min，20%～50% A；4.0～7.0 min，50%～80% A；7.0～9.0 min，80% A；9.0～10.0 min，80%～5% A；流速為1.0 mL/min；檢測波長為254 nm。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

分別對甲醇-水，乙腈-水，甲醇-0.1%甲酸水，乙腈-0.1%甲酸水四種流動相進行考察，結果表明，以甲醇-水為流動相時，4種目標物的分離度較好，沒有重合，且毒性相對較小，總的分析時間短，保留時間合適，在10 min內可全部出峰。同時結果顯示，在波長為254 nm處，四種目標物都有較高的靈敏度，因此最終確定檢測波長為254 nm。

2.2 超分子溶劑萃取條件的選擇

2.2.1 超分子溶劑的篩選

基于長鏈烷基醇與有機溶劑(例如THF)和水自主裝形成的超分子溶劑，烷基醇的碳原子數種類不同，會導致反向膠束的孔徑不同，從而影響超分子溶劑的尺寸及萃取能力。本實驗固定THF的含量為1 mL，選擇不同碳數的長鏈烷基醇(C8～C12)與THF組成對應的超分子溶劑，在相同條件下對苯甲酸酯類物質進行萃取。在萃取過程中，壬醇/THF/水超分子溶劑體系對四種對羥基苯甲酸酯類物質萃取率較高，且溶解性好操作方便，最終實驗采用壬醇作為萃取溶劑，與THF和水組成超分子溶劑體系。

2.2.2 壬醇用量的優化

本研究考察了壬醇用量分別為250、300、350、400和450 μL時目標物質的萃取率，如圖2所示。如圖所示，隨著壬醇用量的增加，各目標物的萃取率先升高后降低，在壬醇的用量為300 μL時，四種目標物都有較高的萃取率，因此在后續實驗中，壬醇的用量設置為300 μL。

2.2.3 THF用量的優化

THF作為超分子溶劑的重要組成部分，其含量大小是影響萃取率的重要因素。如THF含量過低，那長鏈烷醇會析出沉淀，無法形成超分子溶劑，如THF過高，其會分散在水溶液中，無法實現超分子溶劑體系的有效分層。本實驗考察了THF的用量分別為0.5、0.75、1、1.25、1.5 mL時目標物質的萃取率，如圖所示。隨著THF用量逐漸增大，四種目標物的萃取率先升高后下降，當THF的用量位于為1 mL時，四種目標物的回收率位于86.2%～94.3%之間，且結果較為穩定，因此在后續的實驗中，THF的用量設置為1 mL。

2.2.4 超分子溶劑用量的優化

本研究考察了不同超分子溶劑體積(0.5、1、1.5、2和 2.5 mL)對萃取效率的影響，隨著超分子溶劑體積的增加，對目標物的萃取效率逐漸加強。當超分子體積達到2 mL時，4種對羥基苯甲酸酯類物質都具有較高的萃取率，繼續加入超分子溶劑，萃取率基本維持穩定，無較大變化。因此超分子溶劑最佳用量設置為2 mL。

圖1 (a)壬醇的用量、(b)THF的用量、(c)超分子溶劑體積對萃取率的影響

2.3 方法的評價

2.3.1 對羥基苯甲酸酯類物質的色譜圖

依據1.5的色譜條件，4種對羥基苯甲酸酯類混合物標準溶液的色譜圖如圖2所示。

圖2 四種對羥基苯甲酸酯類化合物標準溶液的高效液相色譜圖

2.3.2 線性范圍、相關系數、檢出限和定量限

依據對應的實驗方法，分析一系列混合物標準梯度溶液，用各標準物的質量濃度(mg/L)和對應的峰面積制作標準曲線，計算線性回歸方程及相關系數。并分別根據信噪比(S/N=3)和信噪比(S/N=10)計算方法檢出限和定量限，結果見表1所示。結果表明，4種對羥基苯甲酸酯類物質在0.1～50 mg/L的范圍內線性關系良好，相關系數均不小于0.9991，檢出限在4.8～5.9 μg/L，定量限在16.1～19.7 μg/L。

表1 對羥基苯甲酸酯類的線性范圍、線性方程、

2.3.3 回收率與精密度

表2 四種對羥基苯甲酸酯類物質的回收率和相對標準偏差

在最優的萃取實驗條件下，在待測樣品中分別添加低(20 μg/L)、中(50 μg/L)、高(100 μg/L)三個水平的混合標準溶液，進行加標回收率實驗，平行測定五組，如表2所示，樣品的平均回收率在92.8%～105.6%之間，RSD在1.3%～4.7%之間。

2.4 實際樣品的測定

為了驗證該方法的實際應用，我們隨機對市場上銷售的三種滴眼液中的對羥基苯甲酸酯類物質進行了含量測定。檢測結果表明，在這三種滴眼液中都未檢測到對羥基苯甲酸酯類物質。

3 結 論

本文建立了以壬醇-THF-水為超分子溶劑提取測定滴眼液中對羥基苯甲酸酯類物質的新方法。分別對液相色譜條件，長鏈烷基醇的選擇與用量、THF用量、萃取所用超分子溶劑進行了優化考察,并且通過HPLC實現了同步測定4類對羥基苯甲酸酯類物質。此種方法萃取步驟簡單，綠色環保，消耗體積少且回收率高,適用于滴眼液中羥苯酯類物質的測定。