齦溝液OPG、IL-35、IL-37在慢性牙周炎中的表達及與牙槽骨吸收的相關性

劉曉燕，耿文華，杜莎莎，劉英奇

(河北省邯鄲市中心醫院口腔科，河北 邯鄲 056000)

慢性牙周炎是長期存在的牙齦炎逐漸向牙周組織深部擴張所致的一種口腔疾病[1]。全國流行病學調查顯示，30歲以上群體中約90%患有不同程度牙周疾病，其中以慢性牙周炎最為常見，占比超70%[2-3]。牙槽骨吸收屬牙周炎重要病理變化，正常情況下，牙槽骨吸收與新生維持平衡狀態，牙槽骨高度恒定，但受牙周炎癥影響，若骨吸收增加和(或)骨新生降低并存時即出現骨喪失致牙齒支持組織喪失，牙齒松動，最終拔除或脫落[4]。近年有關牙槽骨吸收的治療主要從牙周治療、控制局部炎癥和菌斑等方面入手，但此疾病病機復雜，尤其是30歲以上群體，除與局部炎癥、免疫有關外，還可能與骨流失有關[5-6]。因此，積極明確牙槽骨吸收相關生化過程對完善干預方案至關重要。核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)是骨形成及吸收耦聯的關鍵環節，而骨保護素(osteoptegerin，OPG)是RANKL引誘受體，其水平變化可直接影響骨代謝[7]。白細胞介素(interleukin，IL)-35、IL-37是近年新發現的與免疫、炎癥有關白細胞介素家族成員，其水平變化與多種炎性疾病有關[8-9]。但慢性牙周炎患者齦溝液OPG、IL-35、IL-37水平及與牙槽骨吸收間關系如何鮮見報道，本研究對此探討，旨在為臨床進一步探明牙槽骨吸收病理生理機制提供參考。報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年12月—2021年10月慢性牙周炎患者105例作為試驗組，再選取同期慢性牙周炎患者45例作為驗證組，同期健康體檢者105例為對照組。試驗組男性59例，女性46例，年齡28～69歲，平均(47.98±8.44)歲；體重指數17～26 ，平均22.06±1.68；慢性牙周炎病程1～7年，平均(3.56±1.08)年；吸煙情況：每日吸煙20例，偶爾吸煙16例，從不吸煙或已戒69例；飲酒情況：過度飲酒19例，適度飲酒34例，從不飲酒或已戒52例。驗證組男性27例，女性18例，年齡26～68歲，平均(48.35±7.22)歲；體重指數17～26，平均21.89±1.53；慢性牙周炎病程1～8年，平均(3.41±1.03)年；吸煙情況：每日吸煙9例，偶爾吸煙7例，從不吸煙或已戒29例；飲酒情況：過度飲酒9例，適度飲酒13例，從不飲酒或已戒23例。對照組男性63例，女性42例，年齡27～70歲，平均(48.72±7.36)歲；體重指數17～28，平均21.93±1.41；吸煙情況：每日吸煙22例，偶爾吸煙15例，從不吸煙或已戒68例；飲酒情況：過度飲酒16例，適度飲酒38例，從不飲酒或已戒51例。3組性別、年齡、體重指數、吸煙情況、飲酒情況差異無統計學意義(P>0.05)，試驗組和驗證組慢性牙周炎病程差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

納入標準：①試驗組、驗證組符合慢性牙周炎診斷標準[10]；②全口保留牙≥18顆；③無急性牙齦乳頭炎、齦緣炎等其他牙周疾病；④無嚴重全身系統性疾??；⑤無長期抗生素應用史；⑥對照組全身健康；⑦知情本研究內容，簽署同意書。排除標準：①哺乳及妊娠期女性；②正接受正畸治療者；③入組前3個月內有急慢性感染性疾病史。

本研究經醫院倫理委員會審批通過。

1.2方法

1.2.1齦溝液OPG、IL-35、IL-37檢測 將患牙、牙齦吹干并隔濕，取已備好EP管內濾紙條插進待測牙近中位牙周袋底，留置60 s，若沾染血則棄除，3 min后再插入1條濾紙條，留置60 s，再3 min插入第3條濾紙條。3濾紙條置入相同EP管稱重，按1 g/L換算體積，EP管內加PBS液200 μL，封口，置液氮保存待測。測時取出樣本，室溫解凍，振蕩器振蕩10 min，超聲振蕩1 h，離心10 min(4 ℃，3 000 r/min，半徑8 cm)，收集上清液，采用上海晶抗生物工程有限公司酶聯免疫試劑盒檢測OPG、IL-35、IL-37水平，嚴格參照試劑盒說明書步驟進行操作。酶標儀在450 nm波長下測樣本光密度值，參照標準曲線獲得OPG、IL-35、IL-37水平值。

1.2.2牙槽骨吸收檢測 采用平行投照技術拍攝數碼根尖片，拍攝條件為70 kV，12 V，20 mA。拍攝后采用自帶醫學影像信息系統的測量工具同一牙位牙槽骨破壞區域水平向最大距離、垂直向最大距離。

1.3觀察指標 ①比較試驗組和對照組齦溝液OPG、IL-35、IL-37水平；②比較試驗組不同臨床特征患者牙槽骨吸收比例；③分析試驗組牙槽骨吸收比例的影響因素，并建立多元線性回歸模型；④組外驗證。

1.4統計學方法 應用SPSS 25.0統計軟件分析數據。計數資料比較采用χ2檢驗。計量資料比較采用t檢驗、單因素方差分析和LSD-t檢驗。采用多元線性回歸模型分析牙槽骨吸收比例的影響因素，并繪制回歸方程評估牙槽骨吸收比例與實際檢測值的散點圖，求出平均絕對偏差(mean absolute deviation，MAD)值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1試驗組和對照組齦溝液OPG、IL-35、IL-37比較 試驗組齦溝液OPG、IL-37水平低于對照組，IL-35水平高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 試驗組和對照組齦溝液OPG、IL-35、IL-37比較Table 1 Comparison of OPG, IL-35 and IL-37 in gingival crevicular fluid of experimental group and control group

2.2試驗組不同臨床特征患者牙槽骨吸收比例比較 105例患者牙槽骨吸收比例為(20.06±6.56)%。不同年齡、病程、牙齒數量、病情程度、吸煙情況、定期口腔檢查、維生素D缺乏、合并糖尿病、齦溝液OPG、IL-35、IL-37水平患者牙槽骨吸收比例差異有統計學意義(P<0.05)。不同性別、體重指數、飲酒情況、定期洗牙、不良修復體、偏側咀嚼、偏好甜食、刷牙頻次、每次刷牙時間、刷牙方式、牙線使用頻次、口腔疾病史、營養不良、維生素C缺乏、合并高血壓、合并高癥血癥、合并骨質疏松患者牙槽骨吸收比例差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 試驗組不同臨床特征患者牙槽骨吸收比例比較Table 2 Comparison of the proportion of alveolar bone resorption in patients with different clinical characteristics of the experimental group

表2 (續)

2.3多元線性回歸分析 以患者牙槽骨吸收比例作為因變量，以表2中差異有統計學意義的項目為自變量，進行多元線性回歸分析，結果顯示，齦溝液OPG、IL-35、IL-37水平是牙槽骨吸收比例的影響因素(P<0.05)。建立回歸模型為：牙槽骨吸收比例=6.495-0.180×OPG+0.169×IL-35-0.055×IL-37，差異有統計學意義(P<0.05)。自變量可解釋牙槽骨吸收比例91.5%的變異量。見表3，4。

表3 變量賦值表Table 3 Variable assignment table

表4 多元線性回歸分析Table 4 Multiple linear regression analysis

表4 (續)

2.4組外驗證 采用驗證組45例患者齦溝液OPG、IL-35、IL-37水平對回歸模型進行驗證，其MAD值為1.25%。見圖1。

圖1 組外驗證散點圖

3 討 論

牙槽骨吸收是在牙周炎長期刺激下造成骨吸收/骨形成平衡偏移而出現的一種病理性改變[11]。慢性牙周炎發病機制十分復雜，涉及骨吸收、骨重建及免疫炎癥等多個過程，造成此疾病極易反復，而進一步了解其病理機制相關生化信息是指導臨床完善治療方案的關鍵環節。

臨床證實，牙周炎整個病程中牙槽骨吸收與成骨細胞活力下降、破骨細胞活力及膠原水解活性增加關系密切[12]。OPG是腫瘤壞死因子家族主要成員之一，其由成骨細胞生成并分泌，主要生理作用是通過與RANKL競爭性結合破骨細胞表面RANKL受體以抑制破骨細胞激活[13-14]。本研究發現，慢性牙周炎患者齦溝液內OPG水平顯著低于健康群體，由此說明慢性牙周炎病情進展可能與OPG水平變化有關。但近年較多研究指出，慢性牙周炎患者牙周狀況是多種因素互相和(或)共同作用的結果，維生素D缺乏、合并糖尿病、慢性牙周炎病情中/重度等均可能造成或促進牙槽骨吸收[15-16]。本研究結果顯示，不同年齡、病程、牙齒數量、吸煙情況、維生素D缺乏患者牙槽骨吸收比例差異有統計學意義，與上述研究存在一定異同，同時也說明慢性牙周炎發生發展病機的復雜性。此外，OPG低表達患者牙槽骨吸收更嚴重(平均值達21.71%)。分析此機制可能是：①OPG是成骨細胞生成的唯一一種破骨細胞負向調節因子，可作用于破骨細胞分化末期，抑制破骨細胞前體細胞分化及誘導破骨細胞凋亡繼而促使骨平衡向骨形成一方偏移[17]。②RANKL是一種骨吸收重要細胞因子，其在體外可誘使形成破骨細胞，在體內可促使破骨細胞成熟，而OPG能特異性與RANKL結合，通過抑制其誘導破骨細胞形成及成熟等過程，促進骨形成[18]。因此，當慢性牙周炎患者齦溝液OPG低表達時可能會因骨新生遲緩，而骨吸收活躍最終出現牙槽骨吸收的病理性改變。繼續多元線性回歸分析發現，齦溝液OPG升高有助于預防牙槽骨吸收。

另外，齦溝液OPG水平受免疫、炎性多種因素影響[19]，同時研究證實，免疫及炎性改變既是慢性牙周炎發生發展的病理生理特征，又是其發生發展的促進因子[20]。IL-35、IL-37是近年研究熱點，認為二者與多種免疫及感染性疾病有關[21]。IL-35是Treg分泌的一種炎癥抑制性細胞因子；IL-37是IL-1家族新成員，但與其他成員不同的是，其既是一種抗炎因子，又兼具免疫抑制作用。有研究表明，牙周組織受微生物感染時齦溝液IL-37水平降低，治療后其水平回升[22]。本研究結果顯示，慢性牙周炎患者齦溝液IL-37水平降低，IL-35水平升高。但IL-35、IL-37同作為免疫、炎癥相關因子，表達趨勢相反的機制可能是慢性牙周炎大量生成促炎因子時，IL-37作為重要抗炎因子，其被Treg分泌后便與靶細胞上受體結合并移位至細胞質，通過調節信號通路磷酸激酶激活狀態而發揮抗炎作用，造成釋放入齦溝液內的水平下降，而IL-35具有獨特的炎性免疫抑制活性，其不僅能調節細胞周期停滯，阻滯Treg細胞增殖，同時IL-35與iTreg間存在正反饋調節作用，可通過促進iTreg分化生成Treg細胞而大量分泌IL-35。因此，當慢性牙周炎發生發展時，齦溝液IL-35、IL-37表達并不一致。進一步建立多元線性回歸模型發現，齦溝液OPG、IL-35、IL-37是牙槽骨吸收比例的影響因素。但本研究不足之處在于齦溝液取樣本身影響因素很多，生活習慣、口腔衛生、合并基礎疾病等雖然能一定程度上減少混雜因素影響，但仍無法完全，如何進一步提高研究準確性可作為今后研究方向。

綜上所述，慢性牙周炎患者齦溝液OPG、IL-37低表達及IL-35高表達均會加劇牙槽骨吸收。