LAG-3及腫瘤浸潤淋巴細胞在食管鱗狀細胞癌患者預后中的作用

劉 堯,靳 晶, 孫雪梅,劉 靜,王肖肖,劉月平*

(1. 河北醫科大學第四醫院病理科，河北 石家莊 050011；2. 河北醫科大學第四醫院腫瘤研究所，河北 石家莊 050011；3. 河北省廊坊市中醫醫院體檢中心，河北 廊坊 065000)

食管癌是世界范圍內常見的癌癥相關死亡原因之一，其是東亞和中東地區的主要組織學類型[1]。對于食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)患者的預后并沒有明顯改觀。因此，開發新的免疫治療靶點和尋找有效的ESCC分子預測因子和替代治療方法迫在眉睫。在腫瘤微環境中，腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)越來越受到關注，有許多證據表明ESCC中TILs數量增加[2-3]。有研究表明，TILs表面可見淋巴細胞活化基因3(lymphocyte activating gene 3,LAG-3)的高表達[4]。在多種腫瘤中也發現了LAG-3的免疫調節作用，包括肝細胞癌、腎細胞癌、膠質瘤等[5-7]。LAG-3不僅能調節T細胞的功能，其與預后也存在關聯[8]。本研究中回顧性分析60例ESCC患者，探討LAG-3的表達、TILs及其相關性，并評估LAG-3在ESCC中的預后價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 篩選2018—2019年河北醫科大學第四醫院經手術切除后病理診斷明確且術前未進行新輔助治療的ESCC手術患者60例，所有切片均由2位高年資病理醫師復閱核實，根據WHO第5版消化系統腫瘤病理學和遺傳學分類標準進行，確定診斷無誤。按照美國癌癥聯合委員會(American Joint Committee on Cancer,AJCC)和國際抗癌聯盟(Union International Center of Cancer,UICC)聯合發表的第8版臨床分期進行分期。60例ESCC患者均經隨訪中心電話隨訪或來院復查，隨訪截止時間為2020年12月。

所有入選患者均同意手術樣本使用且簽訂書面同意書，且本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2試劑及儀器 ST5020染色機、脫水機、包埋機購自徠卡顯微系統(上海)貿易有限公司；蘇木素、伊紅購自武漢博爾夫生物科技有限公司；RM2135石蠟切片機購自徠卡顯微系統(上海)貿易有限公司；兔抗人LAG-3單克隆抗體購自Abcam公司(EPR20261)；全自動免疫組織化學機購自深圳市永年科技有限公司；聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)引物為上海生工生物工程股份有限公司合成。紫外分光光度計購自美國NanoDrop公司，PCR 儀購自日本TAKARA公司。

1.3方法 60例ESCC標本均經3.7%多聚甲醛固定，常規脫水、透明及石蠟包埋；將蠟塊固定于RM2135石蠟切片機上，切成4 μm厚的薄片，45 ℃水中展片和貼片，以及56 ℃恒溫箱中烤片，常規進行蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining)。免疫組織化學采用EnVision兩步法進行，抗體稀釋濃度為1∶150，DAB顯色，蘇木精復染。石蠟切片脫蠟、水化及自來水沖洗，根據試劑說明書對組織進行抗原修復，切片陽性對照為人正常扁桃體組織，陽性標準為細胞質著色。

1.4染色結果判定 LAG-3免疫組織化學染色定位于細胞質，人正常扁桃體組織可見散在LAG-3陽性信號，在ESCC中，LAG-3陽性表達于TILs上，而腫瘤細胞上為陰性。TILs的評估根據浸潤程度分為低度浸潤(TILs<10%)、中度浸潤(10%≤TILs<40%)和高度浸潤(TILs ≥40%)[9]。

1.5組織總RNA的提取 將凍存于液氮罐中ESCC組織取出，提取 RNA(操作按試劑盒說明書進行)。 用紫外分光光度計測定總 RNA純度和含量，在260 nm和280 nm處的紫外吸光度值比值在(2.0±0.1)之間。分別取RNA 5 μg進行逆轉錄，操作過程按試劑盒說明書進行，以18 s rRNA為內參照。LAG-3所使用的引物上游為5′-GGTACCG-CCACCATGTGGGAGGCT-3′，下游為5′-ATGG-TGAGAGCCTCCACCCCCGAGGTGGCCTGCT-3′。

1.6統計學方法 應用SPSS 27.0統計軟件分析數據。Spearman相關性分析LAG-3的表達與臨床病理特征的的關系，Kaplan-Meier生存分析和多因素COX回歸分析評估患者無進展生存期(progression-free survival,PFS)和預后影響因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1臨床資料 60例ESCC患者年齡42～77歲，平均(63.4±9.2)歲；腫瘤直徑1.0～5.8 cm，平均(3.34±1.41)cm；腫瘤位于食管上段8例，中段32例，下段20例；腫瘤分化程度為高分化者19例，中分化者27例，低分化者14例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期為24例，Ⅲ～Ⅳ期為36例；淋巴結陽性的患者48例，淋巴結陰性的患者12例；低度TILs 21例(35.0%)，中度TILs 27例(45.0%)，高度TILs 12例(20.0%)；LAG-3陽性23例，陰性37例。

2.2LAG-3在食管鱗狀細胞癌中的表達情況 免疫組織化學染色觀察LAG-3在食管鱗狀細胞癌中陽性表達位于細胞質，且陽性信號位于腫瘤浸潤淋巴細胞上，其在食管鱗狀細胞癌中的陽性率為38.3%(23/60)，LAG-3陰性率為61.7%(37/60)。Spearman相關性分析顯示，LAG-3的表達與TILs呈正相關，而與腫瘤分化程度和TNM分期呈負相關(圖1，表1)，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 食管鱗狀細胞癌中LAG-3的表達(SP ×200)

表1 60例食管鱗狀細胞癌中LAG-3的表達與臨床病理學特征的關系Table 1 Relationship between the expression of LAG-3 and clinicopathological features in 60 cases of esophageal squamous cell carcinoma (例數)

用RNA提取試劑盒對對正常食管黏膜組織和ESCC組織抽提細胞總RNA，并利用 RT-PCR檢測LAG-3的mRNA相對表達量，我們發現ESCC組織中LAG-3 mRNA表達明顯高于正常食管黏膜組織(圖2)。

圖2 正常食管黏膜組織和ESCC組織中LAG-3 mRNA的表達水平

2.3食管鱗狀細胞癌中TILs狀態 觀察了全部ESCC的HE切片，并進行了TILs的評估，TILs在食管鱗狀細胞癌中有不同程度的浸潤。在60例ESCC患者中，低度TILs占35.0%(21/60)，中度TILs占45.0%(27/60)，高度TILs占20.0%(12/60)。TILs狀態與LAG-3呈正相關，與腫瘤分化程度和TNM分期呈負相關(圖3，表2)。

圖3 食管鱗狀細胞癌中TILs狀態(HE ×200)

表2 60例食管鱗狀細胞癌中TILs狀態與臨床病理學特征的關系Table 2 Relationship between TILs and clinicopathological features in 60 cases of esophageal squamous cell carcinoma (例數)

2.4預后分析 60例ESCC患者從確診時開始計算生存時間，截止時間為2020年12月，隨訪時間12～36個月，平均24個月。隨訪期內死亡5例，病死率為8.3%。Kaplan-Meier生存分析結果顯示：患者無進展生存期與TNM分期(HR=3.887,95%CI:2.106～6.387,P<0.001)、淋巴結狀況(HR=3.132,95%CI:1.875～5.109,P=0.031)、LAG-3(HR=3.477,95%CI:2.125～5.386,P=0.035)及TILs(HR=3.512,95%CI:2.322～5.271,P=0.041)有關，差異有統計學意義(圖4)。多因素COX回歸分析結果顯示：患者無進展生存期與TNM分期(HR=4.105,95%CI:2.217～6.489,P<0.001)、LAG-3(HR=3.789,95%CI:2.176～6.103,P<0.001)有關。

圖4 患者無進展生存率與臨床病理特征的關系

3 討 論

免疫治療是當今腫瘤治療領域最具前景的發展方向之一，癌癥免疫療法自2013年被科學雜志評為“年度突破”以來，癌癥免疫學提出了一種完全不同的治療癌癥的方法，它針對的是宿主免疫系統，而不是腫瘤細胞[10]。免疫檢查點是調節自我耐受和逃離免疫系統的最重要的免疫球蛋白。目前開發較為成熟的受體靶點包括程序性死亡受體1(programmed death receptor 1,PD-1)及其配體程序性死亡配體1(programmed death ligand 1,PD-L1)和TILs上的細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(cytotoxic T lymphocyte-associated molecule-4,CTLA-4)[11-14],但由于在其相關的抗體治療過程中患者出現了原發性耐藥,新的抗腫瘤靶點的開發與探尋成為新的探究熱點。由于腫瘤細胞可通過免疫檢查點受體來躲避免疫系統的殺傷和識別,這就促使阻斷免疫檢查點受體成為近年來腫瘤免疫治療的新方法和新思路。

淋巴細胞活化基因3(lymphocyte activation gene 3,LAG-3)是一種免疫球蛋白超家族的成員，其全稱為淋巴細胞活化基因3(lymphocyte activation gene-3)，它能負向調控T細胞[15]。Triebel等[16]于1990年發現了LAG-3這一免疫球蛋白，LAG-3分子的cDNA克隆首次被分離出并發現了LAG-3的免疫調控機制。Baixeras等[17]于1992年通過試驗驗證了LAG-3的主要配體是主要組織相容性復合體Ⅱ類分子 。新近的研究表明， LAG-3的一個重要的功能性配體被發現，即為纖維蛋白原樣蛋白1(fibrinogen-like protein 1，FGL1)，并揭示了腫瘤免疫中FGL1-LAG-3通路的功能[18]。Shan等[19]綜述了LAG-3的結構及功能，提出它是一種由498個氨基酸構成的Ⅰ型跨膜蛋白樣的免疫抑制性受體，它可以選擇性表達在活化的T細胞、樹突細胞和NK細胞上。LAG-3免疫球蛋白由4種具有高度同源性的胞外免疫球蛋白超家族類似(IgSF-like)結構域(D1～D4)構成，其對T細胞的調節功能與PD-1類似，主要作為遞送抑制信號的受體起作用[20]。LAG-3蛋白具有負向調節T細胞的功能,在維持機體免疫系統穩態和促進腫瘤免疫逃逸和發揮免疫功能方面發揮了重要角色[21]。作為一種很有潛力的免疫檢查點之一，在腫瘤免疫治療方面LAG-3表現出了很好的效果，治療上發揮了重要的作用[22]。在本研究的食管鱗狀細胞癌隊列中，納入了60例術前未經新輔助治療的ESCC患者，分析并探究了LAG-3在食管鱗狀細胞癌中的表達情況，評估其預后價值并分析其與TILs的相關性，為將來進一步的研究打下堅實的基礎，為將來的臨床干預和研究提供一定的參考價值。近年來許多研究都證明了LAG-3作為一種免疫抑制性受體在腫瘤中具有較好的預后預測價值。一項Ⅱ期結腸癌的臨床研究表明，LAG-3的評估有助于預測結腸癌患者的預后，并能篩選出可能從輔助化療中受益的患者，因此，LAG-3可作為Ⅱ期結腸癌患者的預后生物標志物[23]；Asano等[24]的研究表明，LAG-3可能成為三陰性乳腺癌和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)陽性乳腺癌等高度惡性乳腺癌的生物標志物，可以預測新輔助治療的效果；Wang等[25]的研究表明， LAG-3的表達與CTLA-4表達相關，LAG-3陽性表達與ESCC預后不良有關；而一項關于軟組織肉瘤的研究，LAG-3在腫瘤浸潤淋巴細胞上的表達與較差的存活率相關[26]。在納入的60例ESCC患者中，LAG-3的陽性率為38.3%，LAG-3的表達與腫瘤分化程度、TNM分期和TILs有關，即LAG-3陽性信號更多見于腫瘤高、中分化的患者，且只表達于TILs上，而在腫瘤細胞上不表達，且LAG-3在TILs上的表達在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期的患者低于Ⅰ～Ⅱ期的患者。RT-PCR檢測也證實了LAG-3在ESCC中的相對表達量高于正常食管黏膜組織。LAG-3的表達更趨向于腫瘤高、中分化、TNM分期較早、TILs越高的患者中，提示這些患者將來的預后可能是較好的。在腫瘤微環境中，TILs的存在也是決定免疫檢查點抑制劑抗腫瘤效果的重要因素。腫瘤中高度淋巴細胞浸潤與良好的預后相關，TILs狀態也成為了一個預后有用的指標。在LAG-3高表達的患者中，TILs存在相對較高。TILs狀態與LAG-3呈正相關，與腫瘤分化程度和TNM分期呈負相關。患者的生存分析也證明了LAG-3是與預后高度相關的，提示LAG-3是生存率的獨立預測因子。

總之，LAG-3表達的降低與TNM晚期顯著相關。此外，TILs越多，LAG-3表達水平越高，生存率也越高，提示LAG-3和TILs聯合可作為ESCC預后有價值的生物標志物。后續將進一步擴充數據量，以提高數據支持和ESCC患者免疫檢查點抑制劑治療的可能性。