外源性硫化氫對(duì)斷肢冷保存過(guò)程中缺血損傷的保護(hù)作用研究

鮑海力，劉浩，傅志仁，楊璟輝

近年來(lái)，隨著顯微外科和顯微技術(shù)的不斷進(jìn) 步，斷肢再植手術(shù)日漸成熟，適應(yīng)證也隨之?dāng)U大，一部分原來(lái)無(wú)法再植的肢體也可以保留并恢復(fù)一定功能。影響斷肢再植手術(shù)成活率和術(shù)后斷肢功能恢復(fù)最重要的因素就在于斷肢的保存，包括保存時(shí)間和保存條件等。一方面，戰(zhàn)爭(zhēng)沖突往往發(fā)生在遠(yuǎn)離后方醫(yī)療單位的偏遠(yuǎn)地區(qū)或遠(yuǎn)海島礁；另一方面，許多戰(zhàn)創(chuàng)傷的戰(zhàn)士多會(huì)伴有顱腦外傷、胸腹部多發(fā)傷等需要緊急救治的狀況，需要轉(zhuǎn)運(yùn)至后方醫(yī)院才能夠接受手術(shù)治療。然而，離體的肌肉組織在常溫下缺血6～8 h 就會(huì)形成不可逆的損傷，導(dǎo)致永久性的殘疾［1-3］。因此，如何最大程度地保存離體斷肢的功能，同時(shí)盡可能延長(zhǎng)斷肢離體的保存時(shí)間，對(duì)于斷肢再植手術(shù)的成功具有重要意義。

硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種能夠內(nèi)源性生成的新型氣體信號(hào)分子，在人類和小鼠體內(nèi)都會(huì)內(nèi)源性低濃度地產(chǎn)生，并表現(xiàn)出傳遞細(xì)胞信號(hào)、擴(kuò)張血管以及抗炎的特性［4-5］。有研究表明，在保存液中加入外源性H2S 可以改善移植物的缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）并提高移植物的存活率［6-8］。高滲枸櫞酸鹽腺嘌呤（HC-A）保存液是一種在臨床廣泛使用的器官保存液。本研究將離體斷肢保存在添加了H2S 供體硫氫化鈉（NaSH）的HC-A 器官保存液中，旨在研究外源性H2S 對(duì)斷肢冷保存過(guò)程中缺血損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 保存液及其配制 HC-A 保存液（上海長(zhǎng)征醫(yī)院提供）；NaHS（上海生化試劑公司產(chǎn)品）；本研究在HC-A 保存液中加入150 μmol/L NaHS（即5.1 mg/L H2S）。1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選用6～8 周C57/B6 健康雄性小鼠，體重（22 ± 5）g，采用數(shù)字表法隨機(jī)將其分成3 組，每組8 只。分別為干燥冷藏保存（對(duì)照）組、HC-A 保存液（HC-A）組以及含有H2S 的HC-A保存液（H2S）組。

1.3 斷肢的分離和保存 用4%水合氯醛按10 ml/kg腹腔注射麻醉C57/B6 小鼠，用剪刀離斷小鼠后肢股骨上段，取得斷肢。將取得的小鼠斷肢常溫放置半小時(shí)后，按分組方式分別置于干燥環(huán)境、HC-A 保存液和加了H2S 的HC-A 保存液中，并全部在4°C的環(huán)境中保存36 h。

1.4 樣本獲取及HE 染色 保存36 h 后，將各組斷肢取出，從斷肢股四頭肌切取約1 cm×1 cm×1 cm的肌肉組織樣本，放入4%的多聚甲醛中固定，并用石蠟包埋，切成4 μm 的薄片，行蘇木素-伊紅（HE）染色，之后于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察肌肉組織樣本形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。隨機(jī)選取股四頭肌中央部分，觀察肌纖維和半球形肌纖維的數(shù)量，并用圖像分析系統(tǒng)Image J 分析損壞的肌纖維百分比。

1.5 透射電鏡檢測(cè)肌肉組織超微結(jié)構(gòu) 取3 組用不同保存方式分別保存36 h 后的小鼠斷肢股四頭肌組織塊，迅速修剪成1 mm×1 mm×1 mm 大小并迅速放入4°C 電鏡固定液中4 h，進(jìn)行漂洗后固定、脫水、滲透、包埋、切片及染色，然后在透射電子顯微鏡（HITACHI）下觀察組織超微結(jié)構(gòu)并采集圖像進(jìn)行分析。

1.6 免疫熒光檢測(cè) 將小鼠肌肉石蠟切片依次脫蠟水化，抗原修復(fù)液（改進(jìn)型檸檬酸鈉抗原修復(fù)液）修復(fù)，BSA 封閉液室溫封閉30 min，加入一抗［微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）1∶500］4°C 避光過(guò)夜，相應(yīng)二抗（山羊抗兔1∶100）室溫孵育50 min，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）復(fù)染細(xì)胞核，抗熒光淬滅封片劑封片。在倒置熒光顯微鏡（日本尼康）下觀察并采集圖像。每張切片在相同區(qū)域選5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)LC3 陽(yáng)性細(xì)胞比例。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用百分比（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)分析肌肉樣本 在對(duì)照組的肌肉樣本中，可以觀察到高水平的肌肉纖維損傷和大量的肌肉細(xì)胞壞死。在HC-A 組和H2S 組的肌肉樣本中也可見部分肌肉纖維損傷和局部區(qū)域肌肉細(xì)胞壞死；但H2S 組肌肉組織的肌纖維損傷百分比顯著低于HC-A 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1及表1。

表1 各組肌肉組織損傷的肌纖維占比比較（%）

圖1 各組肌肉組織的病理圖（HE×20）

2.2 透射電鏡觀察肌肉超微結(jié)構(gòu)損傷 在透射電子顯微鏡觀察到的結(jié)果和光鏡下組織病理結(jié)果一致。在對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)骨骼肌肌節(jié)幾乎全部破壞，呈碎片狀，無(wú)法辨認(rèn)各線、帶，線粒體（M）體積增大，呈空泡狀改變。HC-A 組中部分骨骼肌肌節(jié)被破壞，成片狀，部分肌原纖維結(jié)構(gòu)消失或塊狀聚集，各線帶不整齊，線粒體（M）大部分分嵴消失，出現(xiàn)空泡樣變性。而H2S 組的骨骼肌樣本結(jié)構(gòu)基本清楚，局部可見肌節(jié)破壞，各線、帶結(jié)構(gòu)基本整齊，線粒體（M）輕度腫脹，線粒體嵴和線粒體膜結(jié)構(gòu)基本完整。見圖2。

圖2 各組透射電鏡下觀察骨骼肌超微結(jié)構(gòu)變化（標(biāo)尺：上方圖為50 μm，下方圖為10 μm）

2.3 H2S 對(duì)LC3 蛋白表達(dá)的影響 LC3 蛋白是自噬特異性標(biāo)志物，存在于自噬小體的表面，LC3 水平可以反應(yīng)自噬小體的數(shù)量。在LC3 特異性免疫熒光的結(jié)果中可以觀察到，H2S 組的LC3 陽(yáng)性細(xì)胞（綠色熒光）數(shù)量較HC-A 組顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3 和表2。

表2 各組LC3 陽(yáng)性細(xì)胞比例比較（± s）

表2 各組LC3 陽(yáng)性細(xì)胞比例比較（± s）

注：與對(duì)照組比較aP＜0.01，與HC-A 組比較bP＜0.01

組別對(duì)照組HC-A 組H2S 組LC3 陽(yáng)性細(xì)胞比例16.89%±2.69%32.25%±3.95%a 60.98%±8.61%ab例數(shù)888

圖3 各組LC3 免疫熒光染色結(jié)果

3 討論

當(dāng)前臨床上用于保存斷肢的方法主要用干燥冷藏法，該方法是將斷肢用含生理鹽水的紗布包裹并迅速置入干燥的低溫環(huán)境［9］。離體斷肢的保存方法已經(jīng)在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)都沒(méi)有得到發(fā)展，但是離體斷肢的保存在研究中卻得到廣泛的關(guān)注，包括選用器官保存液、最適溫度、移植前對(duì)組織進(jìn)行灌注等［10］。許多研究也已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證明，使用器官保存液保存離體斷肢可以降低離體斷肢肌肉、皮膚、神經(jīng)組織的損傷水平，減輕斷肢再植后的肢體IRI，提高斷肢手術(shù)的存活率［11］。本次實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，器官保存液對(duì)于斷肢離體后的保存具有良好的保護(hù)作用。

H2S 是第3 種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，在哺乳動(dòng)物的體內(nèi)可以內(nèi)源性生成，并在多種生理和病理?xiàng)l件下發(fā)揮著重要作用。外源性的H2S 治療也已被證實(shí)可以通過(guò)減輕IRI 引起的氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和線粒體功能障礙等途徑來(lái)減少IRI 對(duì)移植物的影響［12-13］。同時(shí)，有證據(jù)表明外源性H2S 可以在許多疾病中誘導(dǎo)自噬而發(fā)揮作用，比如H2S 可通過(guò)誘導(dǎo)保護(hù)性自噬降低結(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖［14］。自噬是一種在進(jìn)化上高度保守的生物學(xué)過(guò)程，能夠降解細(xì)胞內(nèi)功能障礙的細(xì)胞器和受損的蛋白質(zhì)，以提高細(xì)胞在應(yīng)激條件下的生存能力［15］。自噬是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，涉及非常多的分子，典型的分子包括Beclin-1 和LC3 蛋白。LC3 是自噬一個(gè)特異性的蛋白，LC3 蛋白的表達(dá)增高，可以直接反應(yīng)出細(xì)胞自噬水平的升高。已經(jīng)有許多研究表明自噬在肢體的缺血再灌注損傷中也發(fā)揮著一定的調(diào)控作用［16-17］。

本研究表明，在離體斷肢的保存液中加入H2S后可以通過(guò)促進(jìn)自噬發(fā)揮保護(hù)作用。加了H2S 的HC-A 保存液中的斷肢在光鏡病理表現(xiàn)出組織損傷減輕，肌纖維斷裂減少。與此一致的是，在透射電鏡下也觀察到H2S 組的骨骼肌組織纖維結(jié)構(gòu)損傷輕微，線粒體結(jié)構(gòu)更為完整。線粒體是細(xì)胞內(nèi)對(duì)致傷因子十分敏感的細(xì)胞器，所以線粒體的形態(tài)改變通常作為細(xì)胞損害的重要標(biāo)志。透射電鏡和HE 的檢測(cè)結(jié)果一致說(shuō)明，相較于單純HC-A 保存液組，加入了H2S 的HC-A 保存液表現(xiàn)出對(duì)斷肢骨骼肌良好的保護(hù)作用。隨后，在進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)，這種保護(hù)作用和自噬的增加有關(guān)。正常生理情況下，機(jī)體的自噬都處在一個(gè)較低的基礎(chǔ)水平，以維持機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，但是在內(nèi)部或者外部的刺激下，如缺血、炎癥等情況下，自噬水平會(huì)發(fā)生上調(diào)［18］。同樣，有研究證明，自噬水平的增加能延緩輕度缺血應(yīng)激時(shí)細(xì)胞凋亡和壞死的發(fā)生，在細(xì)胞生存中起著重要作用［19］。Dai 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，升高的自噬水平也可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制基質(zhì)小泡的釋放，對(duì)磷酸誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化發(fā)揮保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，H2S 組的離體斷肢較HC-A 組的斷肢表現(xiàn)出更高水平的自噬，同時(shí)離體斷肢肌纖維的損傷程度更小。

綜上所述，HC-A 器官保存液可以在斷肢長(zhǎng)時(shí)間的離體保存中發(fā)揮保護(hù)作用，而在該保存液中加入了H2S 后，H2S 可以通過(guò)上調(diào)骨骼肌細(xì)胞的自噬水平，在斷肢缺血損傷的過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)作用，具有在臨床和軍事領(lǐng)域應(yīng)用的潛力。