差異表達的非編碼RNA在膿毒癥誘導的急性呼吸窘迫綜合征中的作用

閔思敏 張小楠 丁渡山 劉賽賽 李言

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一種ICU中常見的病死率較高的臨床綜合征，ARDS發生時，富含蛋白質的液體在肺泡中積聚，阻止肺部充滿足夠的空氣，從而導致到達血液中的氧氣減少，發生低氧血癥[1-2]。急性肺損傷(acute lung injury, ALI)由嚴重的感染、外傷、休克、吸入有害氣體及中毒等直接或間接因素引起的全身炎癥反應綜合征在肺部的表現，以肺泡及肺實質發生急性炎癥為主要病理特征，其特點是發生低氧血癥、非心源性肺水腫、肺順應性降低和廣泛的毛細血管滲漏[3]。在2012年柏林會議急性呼吸窘迫綜合征分類中，“急性肺損傷”一詞被棄用，建議使用輕度急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)代替急性肺損傷(ALI)[4]。膿毒癥是一種綜合征，其特征是宿主對入侵病原體的反應失調，肺是最早受累也是最常見的衰竭器官[5]。目前，人們通過LPS建立在體或離體膿毒癥肺損傷模型來研究ARDS。在臨床上，ARDS仍然缺乏有效和特異的治療藥物，發病率及病死率仍然高于其他疾病，甚至高達35%～45%[6]。盡管多年來，研究者們對ARDS發病機制進行了各個層面的深入研究，但膿毒癥誘發ARDS發病機制涉及到多個信號通路的調節，多個基因靶點調節機制，所以深入研究ARDS的發病機制，尋找基因治療的新靶點，可為臨床開發ARDS的靶向藥物提供新的見解。

非編碼RNA(Non-coding RNA，ncRNA)是一類功能RNA轉錄本，不能被翻譯成蛋白質。高達80%的人類基因組編碼大量的ncRNA，然而它們通過多種機制調控基因表達。核糖體RNA(rRNA)和轉移RNA(tRNA)是細胞中最豐富的兩種ncRNA類型[7]，其他的ncRNAs根據其大小，是否大于200個堿基分為短ncRNAs(sncRNAs)和長ncRNAs(lncRNAs)，sncRNA包括microRNA(miRNA)，小干擾RNA(siRNA)等。與線性lncRNAs不同，環狀RNA(circRNAs)是單鏈環狀ncRNAs，通常由前體mRNA(pre-mRNA)剪接生成[8]。在功能上，miRNA、lncRNA、circRNA和siRNA是調節轉錄本，在轉錄后水平上，蛋白質的表達可以由miRNA、lncRNA、circRNA和siRNA來調控。近年來人們對miRNA、lncRNA、circRNA和siRNA的研究日益深入，本文就近年來非編碼RNA在膿毒癥誘導的ARDS發病機制中的研究進行綜述。

miRNAs與膿毒癥誘導的ARDS

miRNAs是一種由內源基因編碼的非編碼單鏈RNA小分子，這些反式作用的小RNA主要與特定mRNA的3′非翻譯區中的順式元件結合，通過調節mRNA的轉錄或穩定性，從而發揮調控作用[9]。由于其轉錄后的調控能力，miRNAs參與細胞凋亡和增殖、免疫應答和代謝等生物過程。膿毒癥誘導的ARDS表現為促炎基因網絡的過度激活或者是不受調控的表達，這種現象被稱為“細胞因子風暴”，而細胞因子風暴受到miRNAs的極大影響。所以miRNAs在基因的水平上參與膿毒癥誘導的ARDS，并成為干預治療的一個新靶點。

一、miRNAs通過TLR4/NF-κB信號通路調控膿毒癥誘導的ARDS

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是啟動炎癥反應的重要模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，免疫反應中TLRs識別病原微生物的致炎組分。核轉錄因子-κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)家族有五種蛋白，其中最常見的NF-κB二聚體是由RelA(p65)與p50組成的。TLR4識別LPS所致的炎癥反應，TLR4與LPS結合后可以激活多條途徑對NF-κB進行調控。在髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)依賴性TLR信號轉導通路調控NF-κB途徑中，當MyD88與白細胞介素-1受體相關激酶(Interleukin-1 receptor associated kinases，IRAKs)家族結合時，IRAKs被磷酸化而激活；激活的IRAKs從MyD88上脫離，然后IRAKs與其下游靶點TRAF6(TNF receptor associated factor 6)發生特異性結合。經過各級信號傳遞，IκB激酶(IκB kinase，IKK)激活，下游的NF-κB抑制因子(inhibitor of NF-κB，IκB)被磷酸化，IκB與NF-κB分離并進行泛素化，NF-κB變為激活狀態(圖1)。激活的NF-κB會促使TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎細胞因子呈瀑布式釋放，經血液循環進入肺組織。同時進入肺內的炎癥因子，促進中性粒細胞的進一步聚集，中性粒細胞被激活并釋放大量的溶酶體、氧自由基等造成肺微血管內皮細胞的直接損傷，最終導致ARDS發生發展。Ju M等人實驗數據表明，過表達的miR-27a可直接靶向TLR4阻斷其與LPS的結合，從而通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號軸改善小鼠肺部炎癥和病理損傷[10]。近年來，很多研究發現，通過抑制NF-κB信號通路能實現減輕ARDS炎癥反應，miRNA是抑制NF-κB信號通路的一個有效靶點。Zhu M等人研究表明TLR4是miR-182-5p的靶點，通過構建miR-182-5p過表達載體，證實miR-182-5p通過靶向TLR4阻斷NF-κB信號通路，從而抑制ARDS的炎癥反應和緩解肺部損傷[11]。Yang的研究揭示miR-106a通過結合TLR4的3'-UTR抑制TLR4的表達，當過表達miR-106a時明顯抑制促炎細胞因子的分泌[12]。因此，在膿毒癥誘導的ARDS的治療中，我們可以從阻斷TLR4/NF-κB信號傳導通路出發，通過抑制ARDS中肺部炎癥介質的釋放，改善肺部炎癥病理損傷，為臨床上治療膿毒癥誘導的ARDS提供新的研究方向。

圖1 miRNA在LPS誘導的ARDS中抑制TLR4激活的NF-κB通路及NLRP3炎性小體

二、miRNAs通過NLRP3(Nod-like receptor protein 3,NLRP3)炎性小體調控膿毒癥誘導的ARDS

NLRP3炎性小體是固有免疫的重要組分，可以活化炎癥細胞、調控炎癥細胞因子在促進ARDS的發生發展中，發揮重要作用。已有研究證實膿毒癥誘導的ARDS患者血漿中caspase-1、IL-1β及IL-18的表達水平較正常者，均顯著增高，由于NLRP3炎性小體是caspase-1、IL-1β及IL-18的上游，所以提示發生ARDS時NLRP3炎性小體被激活。已有研究表明，ARDS發生時，在肺泡巨噬細胞中，NF-κB信號通路被激活，NLRP3炎性小體被激活，使巨噬細胞表面的IL-1β表達上調，最終導致肺泡巨噬細胞焦亡，炎癥加重。Zhang等為了驗證miR-223/142與肺巨噬細胞的相互作用，他們將富集miR-223/142的微囊泡選擇性靶向肺巨噬細胞，發現miR-223和miR-142分別通過抑制NLRP3和Asc蛋白協同抑制巨噬細胞中NLRP3炎性小體的激活，減少炎性介質的釋放，緩解ARDS[13]。

三、miRNAs介導外泌體的釋放調控膿毒癥誘導的ARDS

外泌體可由所有類型的細胞分泌，存在于細胞外、具有磷脂雙分子層結構的囊泡[14]。外泌體包含功能蛋白、mRNA和miRNAs，外泌體包裹著它們分泌到細胞外，從而被傳遞到受體細胞而發揮細胞-細胞通訊的作用，從而調節受體細胞功能[15]。已有研究證實，循環外泌體中包含miRNAs[16]，例如內皮祖細胞來源的外泌體可以通過轉移miR-126來減弱ARDS[17]。因此，外泌體逐漸被用作探索各種疾病新的治療策略和藥物傳遞載體，包括肺部疾病，外泌體能減輕肺泡水腫和肺損傷。

外泌體可以在各種細胞之間轉移miRNAs，從而對細胞功能產生影響。因此，外泌體為ARDS的臨床治療提供了一個新的研究方向。Jiang K等人選擇了與炎癥相關的幾種miRNAs，發現miR-155在經LPS處理的小鼠血清中表達最高，表明ARDS小鼠血清外泌體選擇性的轉載miR-155，證明ARDS小鼠的血清外泌體將miR-155轉移到肺巨噬細胞中并激活NF-κB，誘導TNF-a和IL-6的分泌，從而誘發肺部炎癥。此外，研究還發現血清外泌體來源的miR-155，分別通過靶向肌醇-5′-磷酸酶1的Src同源物2(Src homology 2-containing inositol-5′-phosphatase 1，SHIP1)和細胞因子信號傳導抑制因子(suppressor of cytokine signaling，SOCS1)促進肺巨噬細胞增殖和炎癥反應[18]。在研究紅景天苷(Salidroside，SAL)對ARDS的保護作用時，Zheng等人提取肺泡上皮細胞分泌的外泌體，發現分泌miR-146a可調控肺泡巨噬細胞的炎癥通路[19]。LPS誘導miR-146a的表達降低，SAL通過抑制肺泡巨噬細胞中TLR4介導的NF-κB炎癥通路及相關炎癥因子的分泌，增加miR-146a在肺上皮細胞中的表達來治療ARDS。Jiang L等人從內皮細胞(ECs)中提取外泌體，并進行鑒定，然后將外泌體注射到模型小鼠中，發現外泌體miR-125b-5p通過靶向拓撲異構酶Iiα(TOP2A)從而影響ARDS進展[20]。miR-125b-5p升高或內皮細胞源性的外泌體會促進血管內皮生長因子(VEGF)的表達，從而抑制LPS誘導的ARDS小鼠肺組織水腫、炎癥反應和細胞凋亡。

lncRNA與膿毒癥誘導的ARDS

lncRNA主要參與染色質修飾、mRNA衰變、選擇性剪接以及順式或反式轉錄調控等細胞功能[21]。lncRNA可以作為mRNA的競爭性內源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)，在細胞內調控多種分子機制過程。目前已經證實lncRNA在急性肺損傷中發揮著重要作用。

ceRNA是一種細胞內RNA間相互作用的新基因表達調控機制。lncRNA-miRNAs-mRNA構成一個ceRNA網絡，lncRNA通過與miRNAs應答元件(microRNA response elements，MRE)反向互補結合從而靶向miRNAs，進而間接調控mRNA的表達水平。各種微陣列分析表明，患者血漿中異常的ceRNA表達是ARDS的一個標志，肺微血管內皮細胞、肺泡上皮細胞以及巨噬細胞都被證實在ARDS中ceRNA表達異常。

一、lncRNA對肺微血管內皮細胞功能的調控

在ARDS的發病機制中，細胞因子介導的炎癥過程也是內皮細胞(endothelial cells，EC)損傷的關鍵因素。肺微血管內皮細胞(Pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs)功能障礙是ARDS的始動環節。Qiu等人證實MiR-34b-5p是長鏈非編碼RNA牛磺酸上調基因1(lncRNA TUG1)的下游靶點，GRB2相關結合蛋白1(GAB1)是miR-34b-5p的靶蛋白。TUG1過表達抑制miR-34b-5p和上調PMVECs中的GAB1抑制膿毒癥誘導的ARDS中的凋亡和炎癥反應[22]。

二、lncRNA對肺泡上皮細胞功能的調控

越來越多的研究表明，ARDS的病理生理過程以肺泡上皮細胞(Alveolar epithelial cells，AECs)損傷為特征[23]，在ARDS中，AECs通過分泌炎癥細胞因子和趨化因子參與炎癥反應。Zhou等人在LPS誘導的ARDS小鼠模型的肺泡上皮細胞中，觀察到長鏈非編碼RNA核富集轉錄本1(lncRNA NEAT1)高表達，當敲低lncRNA NEAT1時，細胞活力增加、乳酸脫氫酶(LDH)釋放減少、caspase-3/9活性降低，抑制肺泡上皮細胞的炎癥反應。LPS誘導使高遷移率族蛋白B1(HMGB1)及下游晚期糖基化終產物(RAGE)和p-p65/NF-κB的表達增加。然而，lncRNA NEAT1敲除抑制了這種現象。證實了lncRNA NEAT1的抑制可通過HMGB1-RAGE信號通路拮抗LPS誘發的肺泡上皮細胞急性損傷和炎癥反應。廣泛存在于肺泡上皮細胞中的FOXP2(Forkhead box p2)是一種轉錄抑制劑，抑制肺泡II型上皮細胞表面活性劑的分泌，參與ARDS的病理生理過程[24]。Nan等人發現肺腺癌轉移相關轉錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)靶向miR-194-5p調控下游FOXP2的表達，從而抑制肺泡上皮細胞凋亡[25]。

三、lncRNA對肺泡巨噬細胞(Alveolar macrophage，AM)功能的調控

肺泡巨噬細胞是肺部防御病原微生物入侵和肺部損傷的第一道防線。外界損傷因素入侵肺部，肺泡巨噬細胞被激活。lncRNA通過ceRNA機制調控巨噬細胞的炎癥反應參與ARDS的發展。Zhu J等人發現下調長鏈非編碼RNA核內小RNA宿主基因14(SNHG14)可靶向miR-34-3p抑制Wnt1誘導信號通路蛋白(WISP1)來保護LPS誘導的ARDS[26]。Li等人研究證實MAP3K7結合蛋白2(TAB2)是miR-27b在細胞中的靶蛋白，級聯蛋白2(CASC2)作為miR-27b的競爭性內源RNA，CASC2可直接與miR-27b結合。通過下調miR-27b可以增加TAB2的表達，從而保護肺組織免受LPS的損傷[27]。

circRNA與膿毒癥誘導的ARDS

環狀RNA(circRNA)是繼miRNAs和lncRNAs之后的一類特殊的閉環型的非編碼RNA分子,可影響ARDS中的細胞增殖、活化和凋亡性能。基于circRNA分子的穩定性、組織器官特異性等生物學特點，circRNA分子在確定ARDS的生物標志物和新的治療靶點，具有重要作用。

研究者針對缺氧導致的HUVEC中circRNA的表達變化，發現circRNA在膿毒癥ARDS的發病中可能有一定的作用。Bao等人通過盲腸結扎穿刺(CLP)誘導ARDS動物模型，發現與sham組小鼠相比，CLP小鼠肺勻漿中M1標記物(誘導型一氧化氮合酶和CD80)的比例顯著增加[28]。京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析顯示，TGF-β信號通路與上調的circRNA相關。在這個研究中發現所有circRNA都具有miRNAs結合位點。上調chr17、chr14和chr18分別負向調控mmu-miR-7c-5p、mmu-miR-132-3p和mmu-miR124-3p的功能。所有這些miRNA都已被證實能夠促進抗炎反應和M2極化。因此他們推測下調這些靶向miRNAs可以促進M1極化，加重肺損傷。并且，Bao等人的研究首次揭示了巨噬細胞活化中的circRNA表達模式。Shao等人建立了光氣誘導ARDS大鼠模型，并進行了基因本體(Gene Ontology，GO)和KEGG分析，構建了調控網絡來闡明間充質干細胞治療光氣誘導ARDS的分子機制，確定肺損傷的生物標志物和新的治療靶點[29]。他們首次分析了lncRNAs、circRNAs和mRNA在光氣誘導ARDS中間充質干細胞(MSC)處理后的異常表達譜。發現circRNA-3871靶向miR-339，circRNA3235靶向miR-320。這兩種circRNA參與光氣誘導的ARDS進展，并在MSCs治療ARDS中發揮重要作用。

siRNA與膿毒癥性誘導的ARDS

短干擾RNA(siRNA)是通過識別和降解特定mRNA序列來沉默目標基因。它為ARDS治療開辟了一新的道路。但是，由于該技術具有免疫原性、不穩定性、毒性和跨越生物膜的困難等諸多障礙，目前應用受到了阻礙。siRNA專門靶向并下調其mRNA和相應的表達蛋白。siRNA“關閉”特定基因的能力使其具有吸引力[30]，從而開發出高度特異性的治療方法。不幸的是，siRNA是一種陰離子分子，由于靜電與生物膜上的陰離子磷脂相互排斥，無法單獨穿過細胞膜。而且，裸siRNA分子被血清RNA酶快速降解，阻止其直接注射血液治療。現在人們用了肽釘合技術，使天然肽更加結構化，能夠抗蛋白酶降解，并且更具生物利用性，是用于siRNA遞送的短載體[31]。

誘導多能干細胞(iPSCs)可以分化成體內所有的細胞類型。為了規避了異體移植引發的免疫排斥風險以及倫理和法律沖突等問題，可以用患者自身的體細胞制備誘導多能干細胞，用于某些特定疾病的治療。Ju Z等人將尿液中的腎上皮細胞重新編程為人類誘導多能干細胞(hiPSCs)，并從hiPSCs中純化外泌體作為RNAi傳遞系統。他們用pkh26標記hiPSCs外泌體，然后讓其與人原代肺微血管內皮細胞(HMVECs)共培養發現hiPSCs外泌體可以被受體細胞以時間依賴的方式進行內化[32]。然后，用電穿孔法將siRNA引入到外泌體中，形成Exo/siRNA化合物。hiPSCs外泌體可作為天然基因載體，運輸治療性siRNA，從而減弱肺微血管內皮細胞內粘附分子-1的表達和中性粒細胞的粘附，緩解ARDS的炎癥反應。

總結與展望

盡管最近的研究表明，miRNAs在體液中富集，并表明miRNAs可作為治療ARDS的潛在靶點，但其臨床應用仍有待深入研究。此外，人們越來越認識到新的miRNAs在ARDS的臨床治療和早期診斷中均具有重要意義。使用人類血清樣本檢測miRNAs是一種快速簡單的檢測方法。但這一領域目前的研究還都是在較小的患者隊列中進行評估的，因此需要更大規模的患者隊列研究來確定新的miRNAs用于臨床的診斷和治療。值得注意的是，一些研究還報道其他非編碼RNA，如siRNA。siRNA對ARDS治療具有重要意義，因為它具有抑制任何相關基因的潛力。盡管ARDS有廣泛的研究和多個可能的靶點，但仍沒有特異性的藥物治療方法。因此，通過siRNA進行基因沉默，可以為ARDS的臨床治療提供新的理論依據。

然而，無論是miRNAs還是siRNA，我們都是只關注miRNAs和siRNA對應的相關靶點，而缺乏系統的機制研究。因此，lncRNA-miRNA-mRNA構成的ceRNA研究就備受科研工作者的關注，通過lncRNA靶向miRNAs進而間接調控mRNA,系統研究ARDS的發病機制及臨床治療，將成為該疾病的一種潛在研究策略。