噁霉靈微球劑高效液相色譜分析方法研究

堵 宇，陳福良，張奇珍，余曼麗，尹明明

(中國農業科學院 植物保護研究所 農業部作物有害生物綜合治理重點實驗室，北京100193)

噁霉靈(hymexazol)，CAS登錄號為10004-44-1，EINECS登錄號為233-000-6，中文別稱：土菌消，惡霉靈，綠亨一號等，化學名稱3-羥基-5-甲基異噁唑，化學式：C4H5NO2[1]，結構式見圖1。

微球劑過去歸屬于微囊劑，隨著科技的進步及電鏡掃描技術的發展，發現微球劑與微囊劑之間存在明顯區別。國際純粹與應用化學聯合會(IUPAC)及《中國藥典》(2010年版)已將微球劑與微囊劑區別開，并單獨劃分為一類新劑型[2]。微囊劑是以小分子單體經過原位聚合或界面聚合在農藥有效成分(囊芯)表面沉積形成一層包膜(俗稱壁材，亦稱囊壁、囊皮)，有效成分以液態、固態或氣態形式被包封在球體中的微小膠囊，形成一種微細的囊狀結構的球狀顆粒，微囊中的囊皮如果不易破裂，則囊芯有效成分不能完全釋放出來，造成有效成分的浪費；而微球劑則是以可生物降解的天然高分子聚合物通過乳化-溶劑揮發法、乳化-交聯法、相分離法、噴霧干燥法等方法制備的有效成分均勻分散或包埋在載體中而形成均勻微細的球狀實體(實心球)或中空球體(有效成分與載體混合形成的球壁，把空氣包覆在球體中)，微球劑隨著載體的生物降解，有效成分可以完全釋放出來[3]。微球劑目前在醫藥領域研究較為深入，在農藥領域雖然首例于1985年在美國報道[4]，但目前還處于探索階段，暫未在國內外登記。噁霉靈微球劑是由中國農業科學院植物保護研究所創制開發的農藥緩釋新劑型，以海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉為載體材料將有效成分噁霉靈進行包載，具有一定的緩釋作用。有效成分主要用于防治絲核菌、鐮刀菌、腐霉菌等引起的多種土傳病害，是一種高效低毒無公害的內吸性土壤消毒劑和殺菌劑，同時也具有茁壯根系、健苗、壯苗的作用[5,6]。

目前已有文獻報道噁霉靈的高效液相色譜、氣相色譜和液質聯用技術對單一或復配制劑及殘留的檢測分析方法。高效液相色譜以其簡單、快速、重復性好仍為主流的檢測手段，氣相色譜由于配備的檢測器不同，可能還需要進行衍生化處理，消耗更多的有機試劑，但其和液質聯用方法的檢出限一般都明顯低于高效液相色譜法，因此多用于噁霉靈的殘留檢測[7,8,9]，而目前噁霉靈微球劑的定量分析方法尚無公開報道。因此，本文建立了一種測定噁霉靈微球劑的高效液相色譜分析方法，省時、經濟，精密度和準確度滿足定量分析的要求。

圖1 噁霉靈結構式

1 材料與方法

1.1 供試藥劑和試劑

噁霉靈標準品，純度99.0%[沈陽化工研究院農藥檢驗實驗室國家農藥產品質量監督檢驗中心(沈陽)]；甲醇，色譜純(美國FISHER公司)；超純水(杭州娃哈哈集團有限公司)；噁霉靈微球劑(中國農科院植保所研制)。

1.2 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；BSA224S-CW電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]；過濾器：濾膜孔徑0.45 μm (天津市科億隆實驗設備有限公司)；UV-1800紫外分光光度儀(日本島津有限公司)；PM4-1300TL超聲波清洗機(英國Prima公司)。

1.3 高效液相色譜操作條件

采用Agilent Eclipse XDB-C18反相色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇+純水(60∶40)，流速1 mL/min；進樣量3.0 μL；柱溫30 ℃；檢測器波長210 nm；以外標法定量。在本色譜條件下，噁霉靈保留時間約為2.4 min。還可根據不同儀器特點適當改進色譜條件，以獲得更佳效果。噁霉靈標樣及試樣的高效液相色譜圖見圖2。

1.4 測定步驟

1.4.1 標樣溶液的配制

準確稱取噁霉靈標準品0.05 g (精確至0.000 2 g)，置于50 mL的棕色容量瓶中，先加少量甲醇沖潤容量瓶壁并使標準品完全溶解，再用甲醇定容至50 mL，準確移取上述溶液3.0 mL于10 mL容量瓶中，甲醇定容。將上述標準溶液分別系列稀釋至0.003 1、0.062 5、0.125 0、0.187 5、0.250 0、0.312 4 g/L于10 mL棕色容量瓶中，混勻，過0.45 μm濾膜后備用。

圖2 噁霉靈標樣(a)及試樣(b)溶液高效液相色譜圖

1.4.2 試樣溶液的配制

稱取噁霉靈微球劑0.04 g左右(精確至0.000 2 g)于25 mL的棕色容量瓶中，加入適量甲醇超聲處理，最后用甲醇定容至刻度，過0.45 μm濾膜待測。

1.5 測定

按1.3節儀器參數及條件運行液相色譜，待儀器穩定后，取用標準溶液進樣分析，至前后2針檢測的信號值變化小于1.5%后，以標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定。

1.6 結果計算

將測得的2針相鄰試樣溶液及前后2針標樣溶液中的噁霉靈峰面積分別進行平均，按下列算式計算試樣中的噁霉靈質量分數ω(%)。

式中：A1為標樣溶液中噁霉靈峰面積的平均值，A2為試樣溶液中噁霉靈峰面積的平均值；m1、m2分別為稱取的噁霉靈標樣和試樣的質量(g)；P為噁霉靈標準品的純度(%)；k為噁霉靈試樣和標樣的稀釋倍數比值。

2 結果與討論

2.1 檢測器波長的篩選

用紫外分光光度計在190~400 nm吸收波長范圍對噁霉靈進行掃描，發現噁霉靈在207 nm波長處有最大吸收(圖3)，因此選擇210 nm作為噁霉靈的檢測波長。在該波長下，噁霉靈儀器響應較好，無其他雜質峰干擾。

圖3 噁霉靈的紫外吸收譜圖

2.2 提取溶劑、超聲時間的篩選

用超聲波清洗機對試樣進行不同介質(甲醇、乙腈、純水)和不同時間(5, 10, 20, 30, 40, 50 min)的超聲處理。結果表明噁霉靈微球劑在甲醇和乙腈中能分散良好，但在純水中會凝結成塊，導致無法將有效成分充分提取。用甲醇超聲30 min的有效成分質量分數多于超聲5、10、20 min，但相較于超聲40、50 min幾乎沒有差異，并且具有更小的標準偏差。用乙腈作為提取介質很明顯在50 min內有效成分提取不充分，且載藥量呈現隨超聲時間顯著上升的趨勢。微球劑的制備過程中，需要利用載體材料對有 效成分進行包載。但不同類型(黏度、水溶性等)材料對有效成分的包載能力不同，為了保證超聲能將有效成分完全從微球中溶解出來，我們選擇甲醇為提取介質，超聲時間為30 min (圖4)。

圖4 噁霉靈在甲醇(a)和乙腈(b)介質中不同超聲時間與載藥量的關系

2.3 流動相的篩選

流動相由有機相和水相按一定比例混合組成，其中水相部分為純水，有機相部分在甲醇、乙腈中進行篩選。在2種不同的有機相下分別對噁霉靈標樣進行預分析試驗，結果發現它們的分離效果無明顯差異，但考慮到乙腈毒性更大且價格較高，因此選擇甲醇和純水做流動相。當甲醇和純水體積比為60∶40，流速為1 mL/min時，噁霉靈的分離效果良好。

2.4 分析方法的線性相關性

參照1.4.1節，以噁霉靈的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標作標準曲線，進行線性回歸分析(圖5)。在試驗質量濃度范圍內，噁霉靈的質量濃度與峰面積線性關系良好，線性方程為y=11 281.566 4x+ 19.141 2，相關系數R2為0.999 9。

圖5 噁霉靈峰面積與質量濃度關系圖

2.5 分析方法精密度

準確稱取噁霉靈微球劑各5個平行試樣進行色譜分析，計算其中噁霉靈的質量分數，試驗結果見表1。表明該方法精密度良好。

表1 噁霉靈微球劑的精密度測定結果

2.6 方法準確度

稱取同一批次已知含量的噁霉靈微球劑試樣各5份于25 mL棕色容量瓶中，分別加入一定量的噁霉靈標樣溶液，定容，在1.3節的色譜條件下測定。結果見表2。噁霉靈微球劑中噁霉靈的加標回收率為98.8%~100.9%，平均加標回收率分別為100.0%，說明該方法回收率好，準確度高。

表2 噁霉靈微球劑的加標回收試驗結果

3 結 論

本文建立了檢測噁霉靈微球劑中有效成分的高效液相色譜分析方法。該方法線性關系良好，線性方程為y=11 281.566 4x+19.141 2，線性相關系數為0.999 9。噁霉靈微球劑的標準偏差為0.031，變異系數為0.24%，回收率為99%~101%，平均回收率為100%。該測試方法各項指標均滿足NY/T 2887—2016中的要求，具有線性好、精密度好、準確度高、操作簡便等特點，可用于對噁霉靈微球劑產品的質量檢測或提供技術參考。