全自動(dòng)固相萃取-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定釀酒用原輔料中108種農(nóng)藥殘留

葉華夏，黃 箭，薛潤(rùn)萍，李茂春，安明哲，謝正敏

（五糧液股份有限公司，四川宜賓 644000）

白酒釀造主要使用的原輔料為大米、小麥、糯米、玉米、高粱、稻殼，這6 種原輔料在生產(chǎn)儲(chǔ)存過程中，使用的農(nóng)藥會(huì)直接或間接地殘存于釀酒原料中，為釀酒生產(chǎn)過程帶來不良影響，如影響有益微生物的生長(zhǎng)、改變窖泥的性狀，從而影響酒的品質(zhì)。

根據(jù)國(guó)標(biāo)等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，釀酒原輔料大米、小麥、糯米、玉米、高粱、稻殼中常見的農(nóng)藥品種為108種；公司釀酒生產(chǎn)所用的原料糧食的數(shù)量也很巨大，當(dāng)樣品量大時(shí)，人工前處理方法可能會(huì)無法滿足檢測(cè)需要。本研究建立了基于全自動(dòng)均質(zhì)儀、固相萃取儀、平行濃縮儀的釀酒用原輔料的前處理方法，本方法對(duì)樣品處理速度快，可以一次同時(shí)處理多個(gè)樣品，提高了檢測(cè)效率。樣品前處理過程均由儀器完成，消除了人為操作的誤差，使得結(jié)果更加精確可信，滿足生產(chǎn)需要。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料樣品：公司釀酒原輔料大米、糯米、玉米、高粱、小麥混合糧粉。

標(biāo)準(zhǔn)品及試劑：108種農(nóng)藥濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；乙腈（色譜純）；甲苯（色譜純）；正己烷（色譜純）；氯化鈉（分析純）。

耗材：C固相萃取柱（1000 mg/6 mL CNWBOND）、GCB/NH2 固相萃取柱（500 mg/500 mg，6 mL CNWBOND）、0.2 μm有機(jī)系濾膜。

儀器設(shè)備：Raykol Fotector Plus 全自動(dòng)固相萃取儀，Raykol AutoEVA-60全自動(dòng)平行濃縮儀，全自動(dòng)均質(zhì)儀，三重四級(jí)桿氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent Technologies,Inc.7890B-7000C。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 前處理方法

1.2.1.1 樣品的制備

取待測(cè)樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過20 目篩，混勻制成待測(cè)樣，放入容器中備用。

1.2.1.2 樣品提取

稱取20 g 粉碎完成的樣品（精確至0.01 g）于80 mL 離心管中，加入40 mL 乙腈，均質(zhì)器15000 r/min 勻漿提取1 min，加入5 g 氯化鈉，再勻漿提取1 min，離心機(jī)3000 r/min 離心5 min，取上清液20 mL（相當(dāng)于10 g試樣量），待凈化。

1.2.1.3 第一次凈化

將C柱安裝在Fotector Plus 全自動(dòng)固相萃取儀上，活化：約10 mL 乙腈；上樣：將待凈化的乙腈提取液轉(zhuǎn)移到固相萃取柱上；淋洗：15 mL 乙腈淋洗收集所有流出液，具體步驟見表1 所示。采用AutoEVA-60 全自動(dòng)平行濃縮儀將上述收集液氮吹濃縮至1 mL左右。

表1 第一次凈化固相萃取步驟

1.2.1.4 第二次凈化

將GCB/NH柱接在固相萃取裝置上，加入約2 g 無水硫酸鈉于柱上方，下接收集管。活化：約4 mL 乙腈+甲苯（3+1）；上樣：將濃縮液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱上方，以6 mL 乙腈+甲苯（3+1）分三次清洗雞心瓶后轉(zhuǎn)移到固相萃取柱上；洗滌串聯(lián)柱：25 mL乙腈+甲苯（3+1）。詳細(xì)過程請(qǐng)見表2。40 ℃水浴溫度下，將收集液旋轉(zhuǎn)濃縮至0.5 mL，將濃縮液轉(zhuǎn)移至氮吹管中，5 mL 正己烷分3 次洗滌雞心瓶，合并，40 ℃氮吹吹至0.5 mL，再加入5 mL 正己烷，氮吹至體積小于1 mL，供GC/MS/MS 檢測(cè)。

表2 第二次凈化固相萃取步驟

1.2.2 儀器條件

色譜條件：色譜柱：HP-5MS UI Agilent 30 m*0.25 mm*0.25 μm；升溫程序：60 ℃（保持2 min）以5 ℃/min 升溫至280 ℃（保持20 min）；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；載氣：氦氣，純度≥99.999 %；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：He 淬滅氣體：2.25 mL/min；N碰撞氣體：1.5 mL/min；電離方式:EI；掃描方式：MRM；電離能量：70 eV；質(zhì)量掃描范圍：30～550；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；四級(jí)桿溫度：150 ℃；溶劑延遲：5 min。

1.2.3 定性及定量分析

待測(cè)樣品中，檢出的色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)圖譜相一致；進(jìn)行背景扣除后，定量離子、定性離子都出現(xiàn)，定量離子與定性離子的比值需要與標(biāo)準(zhǔn)品中的比值保持一致。本方法采用外標(biāo)法進(jìn)行定量，以標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積與待測(cè)樣品峰面積之比進(jìn)行計(jì)算。農(nóng)藥殘留組分的前級(jí)離子、產(chǎn)物離子、碰撞能量見表3。

表3 108種農(nóng)藥的質(zhì)譜MRM采集參數(shù)

續(xù)表3 (一) 108種農(nóng)藥的質(zhì)譜MRM采集參數(shù)

續(xù)表3(二) 108種農(nóng)藥的質(zhì)譜MRM采集參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

以混合糧粉為基質(zhì)樣品，進(jìn)行樣品基質(zhì)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，添加濃度為0.05 mg/kg 標(biāo)樣進(jìn)行固相萃取凈化，測(cè)試其回收率及精確度（n=6）。詳細(xì)的測(cè)試數(shù)據(jù)見表4。加標(biāo)試驗(yàn)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差需要小于20%。

表4 108種農(nóng)藥回收率及精確度

2.2 與手動(dòng)前處理方法的比較

2.2.1 處理效果的比較

以混合糧粉為樣品，全自動(dòng)前處理方法平行處理3 次樣品，手動(dòng)方法按指定方法處理樣品，檢測(cè)結(jié)果如表5。

由表5 可以看出，全自動(dòng)前處理方法對(duì)樣品檢測(cè)的重現(xiàn)性較好，個(gè)別檢出的農(nóng)殘也與手動(dòng)方法檢測(cè)結(jié)果相符。

表5 不同方法糧粉農(nóng)殘檢測(cè)結(jié)果 (μg/kg)

2.2.2 處理時(shí)間的比較

全自動(dòng)前處理儀器一次可以同時(shí)處理6 個(gè)樣品，因此我們以處理6 個(gè)樣品的實(shí)驗(yàn)時(shí)間來進(jìn)行比較，具體見表6。

由表6 可知，當(dāng)樣品量較大時(shí)，全自動(dòng)前處理方法更加節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

3 結(jié)論

本方法可實(shí)現(xiàn)釀酒原輔料中多種農(nóng)藥殘留樣品的提取和凈化前處理過程全自動(dòng)化，將稱量好的樣品加入溶劑放置于離心管中，通過AH-30 全自動(dòng)均質(zhì)儀進(jìn)行均質(zhì)萃取，保證萃取效果；經(jīng)均質(zhì)提取完的萃取液通過Fotector Plus 全自動(dòng)固相萃取儀對(duì)其進(jìn)行凈化，具有高效性以及良好平行性，可以滿足多種農(nóng)藥的凈化要求；洗脫液通過AutoEVA-60 平行濃縮儀進(jìn)行濃縮，實(shí)現(xiàn)60 個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行，加快濃縮速度，提高實(shí)驗(yàn)效率。與手動(dòng)前處理方法相比，當(dāng)樣品量大時(shí)，本文建立的方法操作省時(shí)，全自動(dòng)儀器處理消除了人為誤差，靈敏度和準(zhǔn)確度都符合要求，可用于釀酒原輔料中多種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)分析。

表6 不同前處理方法時(shí)間的對(duì)比（min）