響應面法優化超聲輔助提取混合植物配料多酚工藝研究

郭維盛，郭和利，郭湧，郭秀權，蘇新國

（1.廣東笑咪咪食品有限公司，廣東 潮州 515638；2.廣東農工商職業技術學院，廣東 廣州 510507）

隨著現代人生活節奏加快，慢性咽炎、無病因咳嗽以及口腔潰瘍等問題成為常態，潤喉糖具有清熱解毒、清肺止咳、清新口氣、提神解困等作用，消費需求不斷升級，2019 年我國潤喉糖市場產量已經達到4.28 萬噸，規模增長至31.62 億元。目前國產潤喉糖的主導產品是含中藥成分的潤喉產品，其作用溫和，以緩解咳嗽、咽喉疼痛為主。潤喉糖產品的配料包括甜味劑、轉化糖、玉米糖漿和藥食兩用中藥提取物，按照一定重量份比,經過混合、加熱熬煮、冷卻、風干、定型、包裝工藝制作而成的固態或半固態甜味食品。常見的藥食兩用資源有甘草、胖大海、薄荷腦、生姜、茯苓、枸杞等，均富含多酚類抗氧化物質，具有潤嗓、消腫、降火、解毒等功效[1]。如何提高多酚類物質的提取率，保持較高的抗氧化活性，對于提升潤喉糖產品質量具有重要的意義。

近年來隨著廣東鄉村振興戰略的實施，廣東省共設立了16 個茶葉相關的現代產業園，在茶葉加工及深加工規模與日遞增的同時，茶產品加工過程中產生了大量廢棄物，如茶渣、茶梗、茶碎末等[2]。其中，茶梗在單叢茶生產中最為常見，約占總量的18%左右，茶梗富含多酚類物質，具有較好的抗氧化活性成分，植物多酚具有清除自由基、抗氧化、延緩衰老、預防心血管疾病、防癌、抗輻射等活性[3-4]，由于茶梗中纖維素含量較高，酚類物質的提取率較低，長期以來茶梗活性成分的研究較少。前期研究表明，潤喉糖混合植物配料可以由甘草、胖大海、干生姜和單叢茶梗按照4：3：1：2 的比例復配，粉碎后添加纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶在50℃下發酵2h，可以破壞茶梗細胞壁和纖維素糖苷鍵，從而有利于后續的多酚類物質提取過程。

提取過程及其工藝參數對植物原料中生物活性成分的提取效率具有密切關系[5-6]。超聲波輔助提取法利用超聲波的機械作用、空化作用、熱效應等，有效地促進多酚等成分溶出，提高目標成分的浸出率，具有綠色高效的特點[7]。響應面法可以通過多因素來優化復雜的提取過程，是優化提取植物中活性成分的一種有效方法[8]，本研究以潤喉糖混合植物配料為原料，采用超聲波輔助提取其多酚類物質，以多酚得率為指標，再通過響應面法對提取時間、提取溫度、乙醇濃度和液料比四個因素，及其交互作用進行優化，研究超聲波輔助提取的最佳工藝參數，后續將為充分開發和利用廣東茶產業的茶梗資源，提高茶葉的附加值提供實驗數據支撐。

一、材料與方法

（一）實驗材料

單叢茶梗：2021 年6 月產自廣東省潮州市登塘鎮世田村叢山茶廠，經過3 次色選后剔除的單叢茶廢棄物。甘草、胖大海、干生姜：2021 年10 月購置于廣州市藥材公司中藥飲片廠，生產時間為2021 年7月。

（二）實驗試劑

沒食子酸標準品、分析純無水乙醇、福林酚、碳酸鈉、30%過氧化氫、抗壞血酸（VC）等均為分析純，購自廣州宴辰生物技術有限公司；纖維素酶（≥15 000 U/g）購自山東信得利生物工程有限公司，半纖維素酶（≥40 000 U/g）購自河北潤步生物科技有限公司，淀粉酶（4U/mg）購自上海閎潞生物科技有限公司。

（三）實驗儀器

BSA123-CW 電子分析天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；820DP 高功率數控超聲波清洗器（深圳市光點超聲波設備有限公司）；UV-27000島津紫外可見分光光度計（島津國際貿易有限公司）；SHA-C 水浴恒溫振蕩器（常州市億能實驗儀器廠）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫療器械廠）。

（四）實驗方法

1.混合植物配料制備

將甘草、胖大海、干生姜和單叢茶梗按4：3：1：2的比例復配，粉碎后過20 目篩，稱取200g 混合植物配料粉，添加800mL 纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶（20：5：1）的復配酶溶液，將pH 值調整至6.5，在50℃下發酵2h，混合發酵液備用。

2.多酚回歸方程的建立

參照胡棟寶等人[9]的方法進行完善，移取1.000 mg/mL 沒食子酸標準品-乙醇溶液0.00mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL 和5.00mL 至50mL 容量瓶中，再加入10.0%福林酚溶液5.00mL。靜置8min后，加入7.5%碳酸鈉溶液4.00mL，混勻后分別用蒸餾水定容至50mL，在25℃室溫下振蕩反應90min后，在765nm 處測定體系吸光度A，并以吸光度A對沒食子酸濃度c（mg/mL）進行線性回歸，得多酚標準品回歸方程：A=118.8c+0.031，R2=0.9916。

3.混合植物配料的多酚提取試驗

稱取10g 混合發酵液（干物質含量按20%計），置于1000 mL 錐形瓶中，以其干物質含量設定在已設定的因素水平表，采用不同的超聲提取時間、超聲提取溫度、乙醇濃度和液料比進行提取，反復兩次。合并提取液，濃縮至50mL，轉移至100mL 容量瓶中，50%乙醇溶液定容，800 r/min 離心10 min 后收集上清液，按照標準曲線建立方法測定多酚含量。

4.多酚提取單因素試驗

準確稱取10g 混合發酵液原料，固定基準提取條件：超聲提取時間30min，提取溫度60℃，乙醇濃度50%，液料比30：1。單因素試驗開展過程中，在所得單因素最佳水平基礎上依次考察提取時間（10min～50min）、提取溫度（40℃～80℃）、乙醇濃度（30%～70%）和液料比（10mL/g～50mL/g）對植物基料多酚提取效果的影響。

5.響應面優化試驗方案設計

分析單因素試驗結果，選定其中的顯著因素為自變量，多酚提取量為響應值，利用Box-Bohnken法在最優提取條件下優化提取試驗方案，Box-Behnken 試驗因素及水平編碼值見表1，超聲提取時間為A 因素，提取溫度為B 因素，乙醇濃度為C 因素，液料比為D 因素，試驗設計編排組合共29個實驗點，其中24 個析因點，5 個中心點。

表1 優化試驗的因素水平表

（五）數據處理

用Excel 2019 進行繪圖，SPSS24.0 進行統計計算，Design Expert 8.06 對響應面實驗結果進行優化。

二、結果與分析

（一）單因素試驗

1.提取時間

如圖1 所示，微波輔助提取對混合植物配料總多酚提取量率的影響。超聲時間從10 min 延長至50 min 的過程中，總多酚的提取量逐漸增加，從最開始的6.5247mg/g 到30min 時達到峰值，為12.4902mg/g，之后又逐漸下降，提取時間延長到50min 的時候，總多酚的提取量只有峰值的88.67%，這可能是因為隨著提取時間的延長，超聲波對多酚化合物等活性物質結構產生破壞，多酚測定值下降，因此選擇30 min 作為響應面的中心點。

2.提取溫度

如圖2 所示，提取溫度在40℃～60℃區間，總多酚的提取量與溫度呈正相關，并在60℃的時候達到峰值。隨著提取溫度的升高，多酚提取量開始下降，在80℃時的得率僅有峰值的72.07%，低于40℃條件下的提取量。提取溫度的升高有利于乙醇等溶劑與提取物進行物質交換，將多酚類物質浸出。由于多酚類物質具有較強的還原性，在浸出的過程中也存在氧化的過程，當浸出量低于氧化量時，則呈現總多酚提取量下降的情況，因此，選擇提取溫度60℃作為響應面的中心點。

3.乙醇濃度

如圖3 所示，多酚提取量隨乙醇濃度的升高而迅速提高，在乙醇濃度為60%時多酚提取量最大，繼續提高乙醇的濃度，多酚的提取量開始緩慢下降，在乙醇濃度為70%時，得率是峰值的96.88%。由于高濃度乙醇對脂溶性成分有更好的溶出效率，擠占多酚的浸出空間，反而抑制了多酚物質的溶出，導致其提取率下降，這與冼麗清[10]的研究結果相近。由于50%濃度乙醇的多酚提取量是峰值的99.49%，相差無幾，因此從經濟性上考慮，選取50%濃度作為響應面的中心點。

4.液料比

如圖4 所示，從10mL/g 開始，多酚提取量隨液料比的提高呈現出先下降后升高再下降的趨勢。在液料比為40 mL/g 時，混合植物配料的多酚提取量為11.3268mg/g，之后下降到峰值的88.61%；液料比在30mL/g 的情況下，多酚提取量為10.9658mg/g，達到峰值的96.81%，而液料比在20mL/g 的時候，多酚提取量為峰值的80.57%。考慮到過大的溶劑用量將增加雜質含量及后續烘干溶劑制備多酚浸膏的工作量和經濟成本，因此，本次實驗選取液料比30mL/g 作為響應面的中心點。

（二）響應面法優化提取工藝

對混合植物配料的多酚得率響應面試驗結果見表2。將所得數據進行多元回歸擬合，得到多酚得率（Y）與超聲波提取各因素變量的二次回歸方程模型：

表2 Box-Bohnken 法優化的提取實驗方案

上述公式中，A 為提取時間(min)，B 為提取溫度（℃），C 為乙醇濃度(%)，D 為液料比（mL/g）。

由Design-Expert 8.0 軟件分析結果，對試驗方差及擬合程度進行綜合分析，方差分析見表3。對比表3 的F 值可知，各因素影響效果的顯著性順序為：D＞A＞C＞B。各因素的二次項均極顯著，這與單因素影響效果不同，顯著性順序為：C2＞D2＞A2＞B2。影響潤喉糖混合植物配料的總多酚提取量的因素主次為：D 液料比＞A 提取時間＞C 乙醇濃度＞B提取溫度。為了檢驗方程的有效性，對超聲波提取多酚的數學模型進行方差分析，并對各因子的偏向回歸系數進行檢驗，結果見表3。

表3 回歸方程的方差分析

回歸方程模型P＜0.0001，極顯著，可預測不同提取條件下的多酚得率。失擬項P=0.2231＞0.05，不顯著，說明上述總多酚提取的回歸方程可良好契合試驗操作，實驗產生的誤差較小。回歸模型下，A、D、AB、A2、B2、C2、D2對總多酚提取量具極顯著影響（P＜0.01）。C、AC、BC、BD 對總多酚提取量具有顯著影響（P＜0.05）。回歸方程總決定系數R2=0.9162，調整決定系數R2(Adj)=0.9056，說明方程的擬合狀況良好，該回歸方程可用于分析混合植物配料總多酚提取效果隨著考察因素、水平變化的趨勢及波動情況。

（三）響應面分析

如圖5 所示，混合植物配料總多酚微波輔助提取各因素存在交互作用。圖5（A）顯示，提取溫度和提取時間對總多酚提取量影響的響應面坡度較為平緩，且等高線均呈卵圓形且曲線間距較大；圖5（B）顯示，乙醇濃度和提取時間對總多酚提取量影響的響應面坡度較為陡峭，其等高線均呈橢圓形且曲線較為密集，表明乙醇濃度與提取時間的交互效應對總多酚提取量具有顯著的影響。圖5（C，D，E，F）顯示，液料比與提取時間、液料比與提取溫度、液料比與乙醇濃度的響應面坡度均陡峭，且等高線呈橢圓形且曲線較為密集，這些結果說明液料比對總多酚提取量的影響更明顯，這與回歸方程的方差分析的結果一致。液料比是影響混合植物配料中總多酚提取量的首要因素。

（四）驗證試驗

根據響應面分析所建立的數學模型，由Design-Expert.12 求解回歸方程，得出最優的總多酚提取方案為：乙醇濃度52.08%，液料比為33.34，提取溫度61.49 ℃，超聲提取時間26.60min，總多酚的提取率13.1144mg/g。對最佳提取工藝條件進行3 次驗證試驗，測得潤喉糖混合植物配料的多酚提取量為13.0682±0.3461 mg/g，與預測值誤差小于1.0%，響應面模型與實際驗證結果擬合情況良好。

三、結論與討論

本研究以潤喉糖的混合植物配料（甘草、胖大海、干生姜和單叢茶梗）中的總多酚提取量為原料，首先通過添加纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶（20：5：1）的復配酶溶液，在50℃下發酵2h，降解混合植物配料纖維，促進多酚類物質溶出。在單因素試驗的基礎上，利用Box-Bohnken 法優化超聲波輔助提取多酚的工藝，獲得該工藝的回歸方程，方差分析表明該方程極顯著，可用于分析因素、水平變化對多酚提取效果的影響。考察因素的顯著性順序為液料比＞超聲提取時間＞乙醇濃度＞超聲提取溫度。試驗確定的最優總多酚提取方案為：乙醇濃度52.08%，液料比為33.34，提取溫度61.49 ℃，超聲提取時間26.60min。在此工藝參數下，驗證試驗表明潤喉糖混合植物配料的多酚提取量為13.0682±0.3461mg/g，接近預測提取量13.1144 mg/g，與預測值誤差小于1.0%。說明實驗模型預測結果較為可靠。響應面模型與實際驗證結果擬合情況良好，可為優化混合植物配料的多酚提取，以及廣東茶葉產業中的茶梗綜合開發利用提供理論依據及數據支撐。