敵敵畏降解菌的篩選鑒定和降解能力研究

張榮，趙振華，白鶴，賈曉強

(1.天津大學 環境學院，天津 300350；2.天津大學 化工學院，天津 300350；3.天津華勘環保科技有限公司，天津 300170)

敵敵畏(DDVP)是一種高效的有機磷殺蟲劑，2018年使用量達到了104t[1]，嚴重污染環境[2]。三氯乙烯(TCE)是含氯污染物的代表物，其已被列入有毒有害水污染物名錄[3]。

DDVP通過光催化化學降解[4]、化學水解[5]和微生物法降解[6]進行降解。目前能夠對DDVP進行降解的細菌如銅綠假單胞菌、鞘氨醇單胞菌等[7-15]，真菌有曲霉屬、木霉屬和酵母屬等[16-18]。對TCE進行降解的有惡臭假單胞菌屬[19-20]、伯克霍爾德氏菌屬[21]。

本研究以DDVP為唯一碳源，從土壤中篩選出多株高效降解菌，研究其對DDVP降解特性和生長最適條件以及對TCE降解情況,對農藥污染土壤的原位修復提供實驗基礎和理論依據。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

DDVP(有效成分含量77.5%)；三氯乙烯由阿拉丁公司購得；細菌基因組提取試劑盒和瓊脂糖凝膠試劑盒均購自博邁德生物技術有限公司；引物由擎科(北京)生物技術有限公司合成；其他試劑均為分析純。

ME204精密天平；FE20K pH計；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器；SW-CJ-2FD超凈工作臺；HNY-111B恒溫培養振蕩器；GC-430氣相色譜儀；HT-TFG-01通風櫥；UV-1200紫外分光光度計；Powercycler 96 PCR儀；DYY-6C電泳儀；LRH-150生化培養箱；DW-HW328超低溫冰箱；ECLIPSE E200顯微鏡；H1650-W臺式迷你離心機。

1.2 土壤樣品采集

于天津市某農藥廠污染地塊采集農藥污染土樣，約100 g，用封口袋封裝留存。

1.3 培養基

1.3.1 無機鹽(MSM)培養基(g/L) NH4NO31，K2HPO41，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.2，NaCl 5，CaCl20.02，FeSO40.05，酵母粉0.02，pH=7.2。

1.3.2 LB培養基(g/L) 蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5。

1.3.3 YPD培養基(g/L) 酵母膏10，蛋白胨20，葡萄糖20。

1.3.4 MRS培養基(g/L) 蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，檸檬酸氫二銨2，葡萄糖20，吐溫80 1(mL/L)，Na2CO35，K2HPO42，MgSO40.58，MnSO40.25，pH=6.5。

1.3.5 富集馴化培養基 MSM培養基依次加10 g/L 土樣+100，300，500 mg/L農藥作為碳源，逐級馴化。

1.4 敵敵畏降解菌分離

參考賀赟[22]的方法,以敵敵畏為唯一碳源，利用菌種馴化、搖瓶富集的方式分離土壤中的降解菌株。具體步驟如下：①在250 mL錐形瓶中加入100 mL MSM液體培養基，并濕熱滅菌。加入100 mg/L 的DDVP，再添加5 g土壤樣品，于30 ℃，200 r/min搖床中培養10 d；②取步驟①中的培養液5 mL加入到200 mg/L DDVP的MSM液體培養基中，放于30 ℃，200 r/min搖床中培養10 d；③取步驟②中的培養液5 mL加入到300 mg/L DDVP的MSM液體培養基中，放于30 ℃，200 r/min搖床中培養10 d。

稀釋涂布后，平板法篩選單菌株。取轉接后經降解的菌液1 mL于1.5 mL移液管中，以10倍稀釋法稀釋成10-5、10-6、10-7、10-8、10-9涂平板，篩選單菌落劃線培養[23]。

1.5 敵敵畏降解菌菌株鑒定

1.5.1 菌株形態學鑒定 分離得到的目標菌株劃線在6種固體培養基平板上，以分離出單菌落，放入30 ℃恒溫培養箱中培養，觀察菌株生長情況及菌落形態、大小、顏色、邊緣等菌落的基本特征。采用革蘭氏染色法確定菌株革蘭氏類型。掃描電子顯微鏡觀察菌株顯微結構。

1.5.2 16sRNA基因序列分析 利用細菌基因組DNA快速提取試劑盒提取目的菌株基因，以上述提取的基因組DNA為模板，使用16SrDNA通用上游引物27F和下游引物1492R， 27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′擴增降解菌株的 16S rDNA 區域序列。經瓊脂糖凝膠電泳驗證，將PCR產物送往金唯智測序公司進行測序，測序結果使用NCBI數據庫中的BLAST程序查找同源序列進行比對分析，確定種屬。

1.6 敵敵畏降解菌生長條件探究

1.6.1 生長曲線測定 將篩選菌株按1%接種率接種于對應富集培養基中，搖瓶培養220 r/min，30 ℃ 恒溫培養。初期每2～3 h取樣測定OD600(即溶液在波長為 600 nm 處的吸光值)，根據菌株生長情況不同，后期可根據具體情況調整測樣間隔時間直至菌株生長到衰退期。

1.6.2 培養條件探究 最適溫度的測定分5個水平，分別為20，25，30，37，40 ℃。每個水平做3個平行實驗。利用分光光度計法測定菌濃。

1.6.3 生長pH條件優化 最適pH值的測定分5個水平，分別為5，6，7，8，9。每個水平做3個平行實驗。利用分光光度計法測定菌濃。

1.7 DDVP降解率及其耐受能力測定

1.7.1 DDV農藥提取及其分析 降解菌株在對應富集培養基中培養活化至對數生長期，離心，去上清，無菌MSM培養基洗滌菌體3次，并對菌體進行稀釋，制成OD600在3左右的菌液，用等體積培養基懸浮菌體，4 ℃保存備用。

將菌液按照1% 的接種比例分別接種于含有DDVP 100，200，300，500，1 000 mg/L的無機鹽基礎培養液中(MSM，不含瓊脂)，搖瓶220 r/min，最適溫度下培養7 d。取上述培養液15 mL，8 000 r/min離心，去除菌體，取上層清液10 mL，加人10 mL丙酮，劇烈振蕩；再加入氯化鈉至飽和，劇烈振蕩1 min，室溫下靜置5 min，使水相與丙酮相分層。移出上層丙酮，過無水硫酸鈉柱，收集流出的丙酮，留待氣相色譜測定。

1.7.2 氣相色譜測定條件 GC-430氣相色譜儀，FID檢測器：檢測用色譜柱為Rxi-1HT(30 m × 0.32 mm × 0.25 μm)非極性色譜柱。方法：進口溫度290 ℃，檢測器溫度300 ℃，載氣為氮氣(99.999%)，流速1 mL/min不分流，進樣1 μL。程序升溫60 ℃ 保持1 min，以30 ℃/min升至130 ℃，再以5 ℃/min升至170 ℃，280 ℃保持2 min。采用色譜純丙酮為溶劑，按峰面積定量。

底物的降解率計算：在每個樣品中，包括對照組和實驗組。在計算出底物殘留峰面積的積分之后，底物降解速率公式如下：

式中,AF指的是殘留底物的峰面積。

1.8 TCE降解率及其耐受能力測定

降解菌株的培養部分同1.7.1節，用正己烷萃取培養基中底物。每瓶萃取 2 次，萃取液取至50 mL 試管中，用有機系濾膜過濾,去掉細微雜質，將樣品裝入 1.5 mL 的干凈的離心管中，置于-20 ℃ 保藏，待氣相色譜測定。

氣相色譜條件同1.7.2節，方法：進口溫度250 ℃，檢測器溫度260 ℃，載氣為氮氣(99.999%)，流速1 mL/min，分流比10∶1，進樣1 μL。 程序升溫40 ℃ 保持4 min，以20 ℃/min升至250 ℃。采用色譜純正己烷為溶劑，按峰面積定量。

2 結果與討論

2.1 DDVP降解菌分離

采用富集培養，逐級馴化，平板劃線分離的方法，從長期受DDVP污染的土壤中分離篩選目的菌，在富集培養基上獲得了5株DDVP降解菌株(圖1A)，命名為PD-1、PD-2、PD-3、PD-4、PD-5。對5株菌進行掃描電鏡觀察(圖1B)，菌落形態特征描述見表1。

表1 菌落形態特征Table 1 Colony morphology

2.2 DDVP降解菌分子生物學鑒定

將各個菌種純化后的PCR產物用DNA測序，獲得的16SrDNA序列在NCBI中比對(表2)。

表2 16SrDNA比對結果Table 2 16SrDNA comparison result

2.3 環境因素對DDVP降解菌生長的影響

溫度對5株菌生長的影響都較大，生長情況在10～40 ℃范圍內呈現先增大后減小的趨勢(圖2A)，檢測培養24 h的OD600值，5株菌的最適溫度分別為25,25,35,25,37 ℃。pH值4.0～9.0范圍內，除PD-1外，其他菌株生長趨勢均隨pH增大而增大(圖2B)，5株菌的最適pH值分別為6，8，7，9，9。

2.4 DDVP降解菌降解率及耐受情況分析

對5株菌進行7 d，5個濃度梯度的降解率測定結果見表3。

表3 DDVP降解率Table 3 Degradation rate of DDVP

由表3可知，5株菌在DDVP 含量100 mg/L下降解程度均超過75%，其中PD-3、PD-4降解率超過了80%，最高降解率為PD-4的82.46%。隨著DDVP濃度的增加，降解率呈下降趨勢，當DDVP含量達到1 000 mg/L時，PD-4降解率為24.89%。

對5株菌進行了TCE降解率測定，在TCE濃度100 mg/L,30 ℃條件下培養5 d，PD-1降解率達到53.57%。5株菌可耐受TCE濃度為500 mg/L。

表4 TCE降解率Table 4 Degradation rate of TCE

2.5 討論

以微生物修復手段為主的含磷農藥污染降解技術是解決土壤農藥殘留的有效途徑。文獻中已經報道了很多能夠降解或無害化農藥殘留的微生物，包括真菌、細菌、放線菌等，其中以細菌為主。蔡穎慧等[13,23]從污染土壤中分離得到甲基桿菌屬DDW-1，在溫度28 ℃,初始pH為7.0條件下,500 mg/L DDVP經 DDW-1菌株代謝3 d后,降解率達63.7%。楊瑞紅等從南疆長期使用有機磷農藥的梨園采集葉片,分離出DDVP降解菌假單孢菌屬PP-Y1，在pH 6.5,培養7 d條件下DDVP降解率達53.4%。本研究從長期受農藥污染土壤中篩選出了5株高效DDVP降解菌，經鑒定1株屬于氣單胞菌屬，4株屬于芽孢桿菌屬，在DDVP 100 mg/L,裝液量100 mL/250 mL，培養7 d條件下，降解率均超過75%，最高達到82.46%，比蔡穎慧和楊瑞紅的研究都高。利用微生物降解DDVP潛力巨大，微生物不僅可以降解DDVP，還可以降解其他含磷污染物和其他含鹵污染物，體現了微生物對環境的強大適應能力。

DDVP降解菌株的效率與環境因素的影響密切相關，溫度、pH、DDVP濃度等因子均可以影響它們的降解率。DDVP濃度對降解率的影響相當大，當DDVP濃度<300 mg/L時， DDVP的增加，會促進菌株生長，當DDVP濃度>300 mg/L時，則抑制菌株生長，這與付文祥等[16]的研究基本相同。DDVP是一種復雜的有機物，一方面可以作為碳源被微生物利用，另一方面，由于DDVP具有一定的毒性，不能被微生物直接利用，當DDVP濃度較大時，會阻礙菌株生長，使生長量和降解率下降。

除含磷農藥對土壤的污染外，以三氯乙烯為代表物的含氯污染物也會對農用土地產生污染。錢麗敏從高濃度三氯乙烯污染土壤中分離出一種叢毛單胞菌Comamonassp.以醋酸鈉為共代謝基質，10 d對TCE降解率超過90%[24]。本文研究了5株菌對TCE的降解和耐受能力，結果表明5株菌能夠有效降解和耐受TCE，說明在實際操作中能夠適應復雜的污染環境，同時對多底物進行降解。

3 結論

(1)從長期受農藥污染的土壤中篩選出了5株對DDVP有良好降解能力的菌株，確定其最適溫度分別為25,25,35,25,37 ℃，最適pH值分別為6，8，7，9，9。

(2)5株菌表現出高效的DDVP降解能力。在DDVP 100 mg/L,裝液量100 mL/250 mL，培養7 d條件下，降解率均超過75%，最高達到82.46%。隨DDVP濃度的增大，降解效率不斷降低，當DDVP濃度為1 g/L時，PD-4降解率為24.89%。

(3) 探究了5株菌對TCE的耐受能力，5株菌在TCE 100 mg/L，裝液量100 mL/250 mL，培養5 d條件下，降解率最高為53.57%，并顯示出對TCE良好的耐受能力。