外源氮對濱海圍墾稻田土壤N2O還原速率的影響機制研究

饒旭東，謝 晴，薛夢琪，周 聰，張耀鴻

（南京信息工程大學，氣象災害預報預警與評估協同創新中心/江蘇省農業氣象重點實驗室，江蘇 南京 210044）

N2O是僅次于CO2和CH4的第三大溫室氣體，其百年尺度上的增溫潛勢約為CO2的298倍［1］，對溫室效應的貢獻約為6%［2］，對全球氣候變化產生重要影響。農業土壤是最重要的N2O來源；研究發現，農業生產活動排放的N2O占人類活動總排放量的52%［3］。然而，排放到大氣中的N2O氣體是土壤N2O產生與消耗過程的綜合結果。目前，絕大多數研究主要關注于不同土壤中N2O的凈排放通量，而忽略了N2O凈消耗量的潛力。事實上，土壤不僅可以是大氣N2O的源，也可以消耗大氣N2O，成為大氣N2O的匯。土壤中N2O的消耗過程包括N2O在土壤剖面內擴散傳輸中被截留的物理過程以及微生物參與的生化代謝過程。其前者受到土壤結構、土壤水氣狀態等物理特性的影響。后者是指含有氧化亞氮還原酶基因（nosZ）的微生物將N2O還原為N2的過程，是土壤N2O消耗的唯一生物途徑。土壤類型、含水量、土壤發育程度、有機碳含量、農作物生長等對這類土壤微生物具有深刻的影響效應，進而對土壤N2O的消耗潛力也會產生重要的影響。例如，研究發現不同類型土壤N2O的消減潛力差別很大，其中紅壤對N2O的消耗速率高達3.7 mg·kg-1·h-1［4］。淹水或厭氧的環境有利于土壤N2O的吸收，水稻田土壤具有很強的N2O消耗能力［5］。然而，不同發育程度的濕地土壤N2O消耗潛力及影響要素還缺乏深入了解。

隨著我國區域經濟的發展，對土地的需求越來越迫切，灘涂圍墾改農田成為解決土地問題的有效途徑［6］。崇明島東灘是中國長江口規模最大、發育最完善的河口型灘涂濕地，在中華人民共和國成立后經歷過多次大規模的圍墾造田工程［7］。圍墾后的濕地不再受潮汐影響，隨后的農作物種植、翻耕、施肥等農業管理措施，形成了一系列不同熟土化進程的圍墾區濕地。不同圍墾年代的濕地土壤，代表了土壤發育的不同時期。其土壤母質本底相對一致、具有完善的年代發育序列，其土壤發育的空間變化可以反映時間尺度上的變化。許多研究發現，隨著圍墾年限增加、熟土化進程的推進，濕地土壤的鹽分含量下降、pH值降低、SO42-濃度減小、有機碳含量增加，表現為土壤綜合肥力增加、可耕性增強［8-10］。在土壤氮轉化方面，李玲等［11］發現，閩江河口濕地圍墾后表層沉積物N2O的產生潛力沒有發生明顯變化。李小飛等［12］認為，崇明東灘濕地中低潮灘土壤的硝酸鹽還原潛力較高，可能與土壤可溶性有機碳密切相關。林黎等［13］則發現，河口濕地圍墾后土壤理化性質的變化強烈影響著土壤微生物的群落結構和數量。郭俊麗［14］發現，外源N2O添加可使不同母質土壤的N2O消耗速率提高，顯著提高N2排放量。那么，在濱海灘涂圍墾改稻田這一熟土化過程中，不同發育進程的濕地土壤N2O消耗潛力如何變化？以及化學氮肥施用對其有何影響？這些科學問題的探索對于深入了解農田土壤N2O消耗潛力的演替特征至關重要。

基于此，本研究以長江口崇明島東灘自然濕地和圍墾后的稻田土壤為研究對象，以空間代替時間的方法，研究外源氮對不同圍墾年限土壤N2O還原過程的影響，闡明土壤發育進程對濕地土壤N2O消耗潛力的影響特征，為我國農田溫室氣體減排提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

供試土壤采自上海市崇明島東灘濕地和圍墾區稻田（31°27′～31°51′N，121°09′～121°54′E），該地區屬于亞熱帶季風氣候，年均氣溫為15.3℃，年均降水量為1003.7 mm。本研究選取東灘濕地保護區的高灘位蘆葦濕地，作為圍墾0年的對照樣點，以LW表示。根據Cui等［15］的文獻說明，在圍墾區內選取圍墾19、27、51、86年的稻田土壤作為不同圍墾年限的稻田樣點，分別記作WK19、WK27、WK51、WK86。采樣時，在每個樣區以S形走線設置6個采樣點，每個點間隔10～15 m，然后用土鉆取0～10 cm表層鮮土，將該6個點的土壤均勻混合成1個混合樣本，重復3次。將土樣裝入密封袋，放入冰盒中運回實驗室，于4℃下保存。

1.2 土壤理化性質測定

將采回的土壤樣品進行本底理化性質的分析測定。土壤有機碳（SOC）用濃硫酸-重鉻酸鉀消煮、硫酸亞鐵滴定法測定。土壤全氮（TN）用凱氏定氮法測定。土壤銨態氮（NH4+-N）和硝態氮（NO3--N）含量采用2 mol·L-1KCl溶液浸提后，AA3流動分析儀測定。土壤pH以水土比2.5∶1混勻靜置后，用數字酸度計測定。土壤電導率（EC）以水土比5∶1浸提溶液用電導率儀測定。土壤硫酸根（SO42-）使用離子色譜法測定。

1.3 試驗處理及培養

選取上述5種不同圍墾年限的土壤，研究4個不同形態氮添加處理下濕地土壤的N2O還原速率。外源氮添加處理分別為（1）添加NH4+-N，（2）添加NO3--N，（3）添加尿素，氮最終濃度均為5 mmol·L-1；以及不添加氮（添加去離子水）的對照處理，每個處理重復3次。采用厭氧培養方法分析土壤的N2O還原速率。具體步驟為：取2.00 g鮮土放入12 mL的Labco頂空瓶中，加入2 mL去離子水，抽真空-充氬氣重復進行3次。室溫25℃避光預培養3 d；預培養結束后再進行抽真空-充氬氣操作3次，向培養瓶中打入2 mL N2O氣體，再加入20 μL氮溶液，使培養瓶中氮最終濃度為5 mmol·L-1。充分搖晃形成均勻泥漿，分別在加入底物后第0、2、4、7、14和21 d，測定培養瓶中的頂空N2O濃度。

1.4 土壤N2O還原速率測定

每次采氣前充分搖晃培養瓶，用微量采樣器采集100 μL頂空氣體轉入12 mL的Labco頂空瓶中，采集之后補充相同量高純氬氣以保持培養瓶內氣壓的平衡。采集的氣體用氣相色譜儀（Agilent 7890B）分析N2O濃度，儀器參數為：前檢測器溫度250℃，H2、空氣和尾吹氣N2流量分別為50、450和25 mL·min-1，后檢測器溫度為250 ℃，尾吹氣氬甲烷流量為2.000 mL·min-1，柱箱溫度為50 ℃，鎳轉化爐溫度為375 ℃。土壤N2O還原速率通過分析培養期間瓶內N2O濃度的變化情況進行計算，計算公式如下：

式中：P是N2O的還原速率，μg·g-1·d-1；dc/dt為培養期間培養瓶上部氣相N2O濃度變化率，μL·L-1·d-1；V為培養瓶上部氣體體積，L；W為培養的鮮土質量，g；MW為N2O摩爾質量，g·mol-1；MV為標準狀態下氣體摩爾體積，22.4 L·mol-1。

1.5 數據處理分析

試驗數據用SPSS 22.0和Excel 2010進行統計分析，其中顯著性差異用單因素方差分析和LSD檢驗；Pearson相關性分析檢驗土壤N2O還原速率與土壤理化性質之間的關系。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質變化特征

蘆葦濕地（LW）的土壤有機碳（SOC）含量為13.53 g·kg-1，圍墾稻田SOC含量范圍為9.55～18.34 g·kg-1（表1）。而 灘 涂 濕 地WK19土壤SOC含量下降明顯，比LW濕地顯著降低了29.42%（P＜0.05）；其后隨著圍墾年限增長SOC顯 著 增 加（P＜0.05），表 現 為WK27、WK51和WK86均顯著高于LW（P＜0.05）。濕地土壤總氮（TN）含量范圍為0.77～1.20 g·kg-1，其中LW樣點的土壤TN顯著高 于WK19、WK27和WK51土壤（P＜0.05），而與WK86則無顯著差異。土壤銨態氮（NH4+-N）和硝態氮（NO3--N）含量分別為5.46～23.37和8.86～18.67 mg·kg-1，WK51土壤NH4+-N和NO3--N含量均顯著高于其他樣點土壤（P＜0.05），而WK19土壤則顯著低于其他土壤（P＜0.05）。WK土 壤pH值 顯 著 低 于LW土 壤（P＜0.05），且隨圍墾年限增加，pH值下降。LW土壤的電導率（EC）為4.80 mS·cm-1，圍墾后EC顯著降低62%～85%（P＜0.05），且隨圍墾年限增加而顯著降低（P＜0.05）。WK土壤硫酸鹽（SO42-）含量范圍為196.07～328.10 mg·kg-1，且隨圍墾年限增加而降低，相對于LW土壤，WK土壤的SO42-顯著降低43%～66%（P＜0.05）。

表1 不同圍墾年限土壤理化性質

2.2 培養過程中N2O濃度變化特征

高濃度的N2O底物供應可反映出所試土壤的最大N2O還原潛力。培養起始各處理的頂空N2O濃度均高于850 μg·g-1（圖1）。隨著厭氧培養進行N2O濃度均呈現明顯下降的趨勢?？傮w而言，在整個培養過程中第0～2 d N2O濃度下降最為明顯，之后第4～21 d保持較為穩定，直至培養結束，說明培養期間的前2 d各土壤樣品表現出最大消耗潛力。此外，無氮對照CK處理中，第2 d后LW土壤的N2O濃度明顯低于其他4種土壤。添加NO3--N處理中，第2 d后WK19和WK27土壤的N2O濃度明顯高于其他3種土壤。

圖1 不同氮添加處理后N2O濃度隨厭氧培養時間的變化規律

2.3 濕地土壤的N2O還原速率

根據上述結果，選取第0～2 d的N2O濃度變化計算出濕地土壤的N2O還原潛力。發現CK處理及添加NH4+-N、NO3--N和尿素處理下，N2O還原速率 分 別 為18.0～36.6、11.5～39.5、15.2～59.5和17.2～38.9 μg·g-1·d-1（圖2）。無氮CK 處理下，圍墾稻田土壤N2O還原速率分別為18.0、26.0、25.3和31.2 μg·g-1·d-1，蘆葦濕地土壤N2O還原速率顯著高于圍墾稻田土壤，是圍墾稻田土壤的1.2～2.0倍（P＜0.05）。添加NH4+-N處理下，WK86土壤的N2O還原速率顯著高于其他土壤（P＜0.05），WK19土壤顯著低于LW土壤的N2O還原速率（P＜0.05），而WK27、WK51土壤與LW土壤之間沒有顯著差異。添加NO3--N處理下，LW土壤的N2O還原 速率顯著高于WK19、WK27和WK51土壤，WK86土壤的N2O還原速率比WK19土壤顯著增加了291.2%（P＜0.05）。添加尿素處理下，LW與WK51土壤的N2O還原速率分別為36.9和38.9 μg·g-1·d-1，兩者之間沒有顯著差異，但顯著高于其他3個樣地土壤（P＜0.05），而且WK86土壤的N2O還原速率最低，為17.2 μg·g-1·d-1。

圖2 氮添加處理下各土壤的N2O還原速率

對于每一個土壤而言，添加外源氮對N2O還原速率的效應各異。WK86土壤在添加氮后變化最為明顯，其中NH4+-N和NO3--N處 理 下 的N2O還原速率相對無氮CK處理顯著升高了27%和91%，而添加尿素處理下土壤N2O還原速率顯著降低了45%（P＜0.05）。氮添加處理均增加了WK51土壤的N2O還原速率，其中以添加尿素最為顯著，提高了54.1%。相反，WK27土壤在氮添加條件下均顯著下降，其中以NO3--N效應最為顯著。對于LW和WK19土壤而言，添加NH4+-N處理顯著抑制了LW土壤的N2O還原速率，而添加尿素處理則顯著提高了WK19土壤的N2O還原速率。

2.4 回歸分析及相關性分析

對稻田土壤的N2O還原速率與圍墾年限進行了回歸分析（圖3）。結果表明，無氮CK處理以及添加NH4+-N、NO3--N處理下，土壤的N2O還原速率與圍墾年限呈極顯著的線性正相關（P＜0.01），表明隨著圍墾年限的增長稻田土壤的N2O還原速率持續增加。其中添加NO3--N處理的N2O還原速率年增長率最高，為0.69 μg·g-1·d-1·年-1，添加NH4+-N處理的年增長率為0.37 μg·g-1·d-1·年-1，分別比CK處理高出343%和140%。相反，添加尿素處理下稻田土壤的N2O還原速率雖隨圍墾年限增加呈下降趨勢，但未達到顯著水平。

圖3 土壤N2O還原速率與圍墾年限的關系

將稻田N2O還原速率與土壤理化性質進行相關性分析，結果見表2。CK、添加NH4+-N和NO3--N處理下，稻田N2O還原速率與SOC、TN均呈顯著（或極顯著）正相關。相反，CK、添加NH4+-N和NO3--N處理下，稻田N2O還原速率與土壤EC、SO42-均呈顯著（或極顯著）負相關。土壤NH4+-N含量與稻田N2O還原速率在無氮CK和NH4+-N添加條件下呈顯著正相關，土壤pH值與稻田N2O還原速率在添加NH4+-N和NO3--N條件下呈顯著負相關。值得注意的是，添加尿素條件下稻田N2O還原速率與土壤理化性質的相關性均未達到顯著水平。

表2 圍墾稻田N2O還原速率與土壤理化性質相關分析

3 討論

3.1 濱海濕地土壤理化性質的變化特征

大規模圍墾活動下，濱海灘涂濕地受到干擾，會深刻影響濕地土壤的理化性質［16］。本研究中，蘆葦濕地SOC相較于圍墾19年稻田土壤高出42%。Davidson等［17］認為由于濕地的大部分有機碳沒有被土壤固定，在向陸地性農田轉變的過程中，好氧條件增強導致有機碳的損失。隨后由于鹽分逐漸下降開始種植農作物、施肥和農作物殘渣以及耕作管理措施使有機碳開始恢復［10，18］，Mitra等［19］和Iost等［20］也有同樣的報道。本研究發現，圍墾86年SOC含量最高，且該稻田SOC含量超過蘆葦濕地碳水平的36%；而蘆葦濕地土壤的TN含量是圍墾稻田土壤的1.1～1.6倍，可能與蘆葦濕地表層存在豐富的固氮微生物有關［21］。土壤pH值、EC和SO42-均表現為蘆葦濕地顯著高于圍墾稻田，且隨圍墾年限增加而呈逐漸下降的趨勢。這與以往的研究報道一致［8-10，22］，表明圍墾后濕地土壤由海洋性特征向陸地性特征演變，將可能會對土壤N2O還原過程產生深刻影響。

3.2 濱海濕地土壤N2O還原潛力的特征比較

無氮添加處理下，濕地土壤的N2O還原速率反映了原狀土壤的N2O消耗潛力。本研究發現，在圍墾稻田中，86年稻田的N2O還原潛力最高，比19年稻田高出73.7%。相關性分析發現圍墾稻田N2O還原速率與SOC呈極顯著正相關。厭氧反硝化作用通常被認為是調控土壤N2O消耗還原的主要過程［23］，在反硝化過程中，有效碳源的供應能夠促進土壤反硝化微生物的生長，從而促進對N2O的吸收量顯著增加［24］。而且，SOC激活了微生物的呼吸作用，加快了土壤中O2的消耗，從而形成厭氧環境，促進N2O還原成N2。此外，當土壤中NO3--N含量很低時，N2O就可能成為反硝化作用的唯一電子受體而被還原為N2。而在圍墾86年稻田中的NO3--N含量顯著高于19年稻田，并不有利于N2O的還原過程。事實上，針對有機碳和氮素對N2O還原的綜合影響而言，有機碳與硝態氮的比值可能更好地反映出兩者對N2O還原過程的整體影響效應。本試驗中圍墾86年稻田的有機碳與硝態氮的比值高于圍墾19年稻田，可能是N2O還原速率存在差異的重要原因。不僅如此，土壤中SO42-作為重要的電子受體進行SO42-還原作用，將與N2O還原過程產生強烈的競爭作用［25］。而圍墾86年稻田中最低的SO42-濃度極大地降低了對N2O還原過程的底物電子競爭，有利于N2O被還原為N2。

值得注意的是，本研究發現蘆葦濕地的N2O還原速率顯著高于圍墾稻田。這可能與蘆葦濕地處于低潮灘區域，土壤含水量較高，長期處于極度厭氧狀態有關。以往研究報道土壤處于極度缺氧的環境中，N2O還原酶活性較高，有利于N2O還原成N2［26］。而且，蘆葦濕地的pH值較高，有報道認為偏堿性pH值較高的土壤中N2O還原酶活性較強，促進N2O還原為N2［27］。此外，蘆葦生長期根系分泌到土壤中的活性有機碳可能不同于水稻根系，導致N2O還原微生物的活性產生差異。聶文婷［28］研究發現，添加葡萄糖和蔗糖會增加N2O的排放量，而添加檸檬酸則會降低微生物活性，使N2O排放量低于其他碳源。

在添加不同形態外源氮后，各個土壤的N2O還原潛力發生改變。其中，NO3--N對圍墾稻田N2O還原速率的促進效應明顯高于NH4+-N，且在圍墾86年稻田土壤中表現最為突出。添加NO3--N條件下，NO3--N可作為底物促進反硝化微生物活性，包括N2O還原微生物，可進一步促進N2O被還原。汪方圓等［29］對本試驗區域進行研究，發現nosZI基因是圍墾稻田土壤N2O還原過程的主要貢獻者；而該基因存在于典型的反硝化型微生物中。因此，添加NO3--N可促進反硝化過程各個反應步驟，同時也有利于nosZI基因介導的N2O還原過程。同時也發現，在圍墾19、27年稻田中添加NO3--N后，N2O還原速率均有不同程度地降低。這可能是因為該稻田土壤中有機碳較低，提供的電子較少，導致外源NO3--N與N2O爭奪電子，進而N2O還原過程被抑制。另外，NH4+-N是大多數微生物氮源吸收的偏好形態。當土壤中添加NH4+-N時，會產生較強的微生物吸收固持作用，導致參與硝化和反硝化作用的底物氮素減少，這可能是導致添加NH4+-N對N2O促進效應低于NO3--N的重要原因。盡管添加NO3--N對稻田土壤N2O還原速率的正效應最高，但它本身是陰離子，不易被土壤膠體吸附而隨水流失；NH4+-N的正效應雖然低于NO3--N，但是容易被土壤膠體吸附，易被土壤微生物吸收利用。從氮素利用率和生態效應兩個方面綜合比較而言，施加NH4+-N對土壤N2O還原速率的綜合效應優于NO3--N。需要指出的是，本試驗采樣厭氧培養試驗研究不同外源氮輸入對土壤N2O還原潛力的影響效應，沒有對相關微生物的功能基因進行分析。在此基礎上，可進一步設置培養試驗研究功能基因nosZ的不同亞群在N2O還原過程中的相對貢獻，揭示其微生物機制，從而建立土壤N2O還原潛力與反硝化微生物豐度和群落結構的內在關系。

4 結論

濱海濕地圍墾改為稻田后，顯著降低了土壤pH值、EC值和SO42-含量。無外源氮添加條件下蘆葦濕地土壤N2O還原速率顯著高于圍墾稻田土壤。添加NH4+-N和NO3--N極大提高了圍墾86年稻田土壤N2O的還原速率。

致謝：在本試驗的野外采樣過程中，上海崇明東灘濕地自然保護區給與了大力支持和協助，在此表示衷心感謝！