姜黃素干預(yù)腎上腺皮質(zhì)癌SW-13細(xì)胞的miRNA調(diào)控機(jī)制▲

黃雪梅 匡雅琪 劉雨平 林媛媛 羅佐杰

(1 廣西南寧市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西南寧市 530022；2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西南寧市 530021)

腎上腺皮質(zhì)癌(adrenocortical carcinoma，ACC)是內(nèi)分泌系統(tǒng)的惡性腫瘤，起病隱匿、惡性程度高、侵襲性強(qiáng)。ACC早期確診率較低，大多數(shù)患者確診時(shí)已出現(xiàn)局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移征象[1-2]，而發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的患者5年生存率不到15%[3]。手術(shù)切除原發(fā)腫瘤及轉(zhuǎn)移病灶是目前ACC的主要治療方法，但是手術(shù)治療不能防止腫瘤的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。對(duì)于不能根治性切除腫瘤或無(wú)法手術(shù)者，常采用化療、放療和分子免疫治療等輔助治療[4-5]。米托坦是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局唯一批準(zhǔn)使用的ACC治療藥物，但治療窗口窄，會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)毒性、腎上腺皮質(zhì)功能不全和急性肝功能受損等嚴(yán)重的不良反應(yīng)，其安全性和有效性仍存在爭(zhēng)議[6-7]。而其他的化療、放療及免疫治療等輔助治療對(duì)ACC的治療效果比較局限[8]。姜黃素是從姜科植物根莖中提取的化合物，具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[9-11]。本課題組前期研究表明，姜黃素可以抑制ACC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)ACC細(xì)胞凋亡，抑制SW-13細(xì)胞荷瘤裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)[12]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)姜黃素在發(fā)揮抗腫瘤作用時(shí)可導(dǎo)致miRNA表達(dá)譜發(fā)生改變[13-14]。然而，目前姜黃素干預(yù)ACC的miRNA調(diào)控機(jī)制尚不明確。因此，本研究通過(guò)高通量小RNA測(cè)序探討姜黃素干預(yù)ACC SW-13細(xì)胞的miRNA調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 姜黃素購(gòu)于美國(guó)Sigma公司(批號(hào)：458-37-7)，NucleoZOL試劑盒購(gòu)自德國(guó)MN公司(批號(hào)：740404)，miRNA 第一鏈 cDNA 合成試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程公司(批號(hào)：B532451)，SYBR Green?Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自TaKaRa公司(批號(hào)：RR820A)。NanoDrop 2000c微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，Agilent 2100生物分析儀購(gòu)自美國(guó)Agilent Technologies公司。

1.2 細(xì)胞來(lái)源、培養(yǎng)和干預(yù)方法 人ACC SW-13細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，使用含有10%胎牛血清的高糖PMEM培養(yǎng)。將細(xì)胞接種在6孔板(5×105個(gè)/孔)中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，次日細(xì)胞貼壁、細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為對(duì)照組和姜黃素干預(yù)組，在對(duì)照組、姜黃素干預(yù)組細(xì)胞中分別加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基2 mL、50 μmol/L姜黃素溶液2 mL，放置在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。使用NucleoZOL試劑盒提取兩組細(xì)胞的總RNA，分別經(jīng)NanoDrop 2000c微量分光光度計(jì)、Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)RNA純度、完整性，將合格的總RNA用于文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 小RNA文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析 小RNA文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序分析均由上海生工生物工程公司完成。其中，采用NEXTseq 550測(cè)序儀(測(cè)序模式為SE75)進(jìn)行測(cè)序；通過(guò)FastQC軟件對(duì)用于測(cè)序的原始序列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，使用Cutadap去除接頭，Trimmomatic去除兩端質(zhì)量堿基和序列過(guò)濾；使用BLASTN進(jìn)行序列與Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，以過(guò)濾掉樣本中的 sRNA、tRNA、snoRNA、snRNA；使用Bowtie分別進(jìn)行序列與人物種的外顯子和內(nèi)含子、參考基因組序列的對(duì)比、過(guò)濾，最后獲得純凈序列。

1.4 miRNA的注釋和新miRNA的預(yù)測(cè) 將獲得的純凈序列與miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mirbase.org/)中收錄的人物種已知miRNA序列和miRNA前體序列進(jìn)行比對(duì)，得到序列的miRNA家族信息。使用miRDeep2軟件，將在Repbase數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.girinst.org/repbase/)過(guò)濾比對(duì)后剩余的序列與參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)后，進(jìn)行miRNA的表達(dá)定量和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，預(yù)測(cè)新的miRNA。

1.5 miRNA的差異性表達(dá)分析、功能和通路富集分析 使用edgeR軟件對(duì)已知miRNA和新預(yù)測(cè)的miRNA進(jìn)行差異性表達(dá)分析，采用RPM(reads per million mapped reads)將數(shù)據(jù)歸一化處理，以P<0.05、|log2FC|>1作為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出差異性表達(dá)的miRNA。在miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)差異性表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。采用clusterProfiler軟件對(duì)獲得的miRNA靶基因進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信號(hào)通路富集分析。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)部分差異性表達(dá)的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。所選miRNA的引物序列由上海生工生物工程公司合成，見(jiàn)表1。采用NucleoZOL試劑盒提取對(duì)照組和姜黃素干預(yù)組干預(yù)24 h后SW-13細(xì)胞的總RNA，檢測(cè) RNA 純度、完整性后，采用miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min，于4 ℃保存。采用SYBR Green? Premix Ex TaqTMⅡ進(jìn)行定量檢測(cè)。反應(yīng)體系共20 μL，包括TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL、ROX Dye Ⅱ 0.4 μL、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、cDNA 2 μL，RNase free H2O 6 μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)，熔解曲線95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。以U6作為內(nèi)參(由上海生工生物工程公司提供)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素干預(yù)組和對(duì)照組miRNA的長(zhǎng)度分布 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行去除冗余接頭、不相關(guān)、低質(zhì)量序列的處理后，獲得純凈序列。miRNA 長(zhǎng)度為21～24 nt，在從對(duì)照組和姜黃素干預(yù)組細(xì)胞獲得的序列中，長(zhǎng)度為21～24 nt的序列占比分別為77.68%和80.67%。見(jiàn)圖1。

圖1 姜黃素干預(yù)組和對(duì)照組miRNA的長(zhǎng)度分布

2.2 miRNA的鑒定與差異性表達(dá)分析結(jié)果 對(duì)獲得的miRNA進(jìn)行差異性表達(dá)分析，篩選出44個(gè)差異性表達(dá)的miRNA，其中21個(gè)miRNA在姜黃素干預(yù)后表達(dá)上調(diào)，23個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。見(jiàn)圖2。

圖2 差異性表達(dá)miRNA 的火山圖

2.3 miRNA靶基因的功能富集分析 預(yù)測(cè)有靶基因且有功能的miRNA共9個(gè)，見(jiàn)表2。GO功能分析結(jié)果顯示，靶基因富集的生物學(xué)過(guò)程有21個(gè)，主要富集于細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化和凋亡等生物學(xué)過(guò)程；靶基因富集的細(xì)胞成分有11個(gè)，主要為細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞膜等細(xì)胞成分；靶基因富集的分子功能有17個(gè)，主要參與DNA結(jié)合、RNA結(jié)合、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)結(jié)合作用和催化作用等分子功能，見(jiàn)表3。在GO注釋分類的基礎(chǔ)上進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，結(jié)果顯示靶基因主要富集在癌癥途徑、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路、細(xì)胞周期和凋亡途徑等19條信號(hào)通路，見(jiàn)表4。

表2 具有功能的差異性表達(dá)miRNA

表3 miRNA靶基因顯著富集的12個(gè)GO條目

表4 miRNA靶基因顯著富集的前5個(gè)KEGG條目

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果 為了進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA測(cè)序所獲得的結(jié)果，隨機(jī)選取6個(gè)miRNA(miR-184、miR-490-3p、miR-766-3p、miR-200b-3p、miR-200c-3p、miR-3622a-5p)采用加尾法熒光定量的方法檢測(cè)其相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，miRNA的相對(duì)表達(dá)量與小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果基本一致。見(jiàn)圖3。

圖3 差異性表達(dá)miRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果

3 討 論

miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可以通過(guò)與靶基因mRNA堿基配對(duì)實(shí)現(xiàn)降解mRNA或抑制mRNA的翻譯表達(dá)，調(diào)控靶基因的表達(dá)[15-16]。小RNA測(cè)序不僅可以鑒定保守的miRNA和預(yù)測(cè)新的miRNA，還能分析miRNA的表達(dá)特征[17]。本研究采用高通量小RNA測(cè)序分析姜黃素作用SW-13細(xì)胞時(shí)的miRNA調(diào)控機(jī)制，篩選出44個(gè)顯著差異性表達(dá)的miRNA，其中21個(gè)miRNA在姜黃素干預(yù)后表達(dá)上調(diào)，23個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)，共有9個(gè)差異性表達(dá)的miRNA有靶基因且有功能；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)其中6個(gè)miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示這些miRNA的相對(duì)表達(dá)量與小RNA測(cè)序分析結(jié)果趨勢(shì)基本一致。miRNA作為致癌因子或腫瘤抑制因子，可成為腫瘤診斷、預(yù)后和評(píng)估治療效果的生物學(xué)標(biāo)志物[18-19]。Xu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-122-5p在胃癌組織和胃癌BGC-823細(xì)胞中呈低表達(dá)，miR-122-5p過(guò)表達(dá)可以抑制BGC-823細(xì)胞的遷移和侵襲性。miRNA可以靶向相關(guān)基因調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，例如miR-214-3p可以通過(guò)靶向調(diào)控Twist家族bHLH轉(zhuǎn)錄因子1來(lái)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞向上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[21]；Zou等[22]亦發(fā)現(xiàn)miR-192-5p通過(guò)靶向作用含三聯(lián)基元44以抑制肺癌的增殖、遷移和侵襲。本研究的小RNA測(cè)序分析結(jié)果顯示，經(jīng)姜黃素干預(yù)后，SW-13細(xì)胞中miR-122-5p、miR-184、miR-214-3p、miR-490-3p、miR-200c-3p、miR-3187-5p、miR-3622a-5p和miR-766-3p表達(dá)上調(diào)，miR-192-5p表達(dá)下調(diào)，這些差異性表達(dá)的功能miRNA將為姜黃素的抗ACC作用機(jī)制研究奠定更多的理論基礎(chǔ)。

GO是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系，其可全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性。GO功能富集分析包括3個(gè)本體，分別為描述基因的分子功能、細(xì)胞成分和生物學(xué)過(guò)程。本研究中，GO功能富集分析結(jié)果顯示，姜黃素干預(yù)SW-13細(xì)胞后，差異性表達(dá)miRNA的靶基因主要富集在細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化和凋亡等生物學(xué)過(guò)程。有研究顯示，姜黃素可以通過(guò)miRNA 的特異性靶向作用抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[23-24]；Gallardo等[25]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以通過(guò)調(diào)控miR-34a的表達(dá)來(lái)抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。由此可見(jiàn)，姜黃素也可能通過(guò)調(diào)控上述miRNA來(lái)抑制細(xì)胞增殖、遷移、分化和凋亡，從而發(fā)揮抗ACC的作用。本研究KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果顯示，姜黃素干預(yù)SW-13細(xì)胞后，差異性表達(dá)miRNA的靶基因顯著富集在癌癥途徑、MAPK信號(hào)通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路、細(xì)胞周期和凋亡通路等。Liu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過(guò)調(diào)節(jié)miR-21以調(diào)控磷酸酶張力蛋白同系物/磷脂酰基醇3-激酶/蛋白激酶B通路，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。本課題組的前期研究顯示，姜黃素可以誘導(dǎo)ACC細(xì)胞凋亡，抑制腎上腺皮質(zhì)癌SW-13裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)[12]。由此推測(cè)，姜黃素可能通過(guò)相關(guān)miRNA調(diào)控上述信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗ACC的作用。

綜上所述，姜黃素可能通過(guò)miR-184、miR-490-3p、miR-766-3p、miR-200c-3p、miR-3622a-5p等miRNA參與調(diào)控癌癥途徑、MAPK信號(hào)通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路、細(xì)胞周期和凋亡途徑等信號(hào)通路，以抑制細(xì)胞增殖、遷移、分化和凋亡，從而發(fā)揮抗ACC的作用，這或可為姜黃素治療ACC提供理論依據(jù)。