注意缺陷多動障礙患兒的外周血miR-30d-5p表達量及其與行為癥狀的關系▲

劉奕君 楊文旭 章 嵐

(電子科技大學醫學院附屬婦女兒童醫院·成都市婦女兒童中心醫院兒童保健指導中心，四川省成都市 611731)

注意缺陷多動障礙(attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)是起病于兒童期的一種精神性障礙疾病，患病率約為5.6%[1]。ADHD患兒存在注意力渙散、多動、沖動等行為癥狀，這些癥狀嚴重影響患兒的正常生活、學習及社會適應能力，甚至會對患兒成年后的人際交往和工作造成影響，該病已成為臨床和社會重點關注的問題[2]。目前，臨床主要采用問卷形式評估ADHD患兒的行為癥狀以進行病情診斷及療效評價，缺乏直觀敏感的分子診斷指標[3]。miRNA是調節基因表達的非編碼單鏈RNA，在神經發育、凋亡、軸突形成等生理病理過程中起重要作用[4]。目前，已有研究將miRNA作為分子標志物應用于精神分裂癥、抑郁癥等精神性疾病的診斷和病情評估，其臨床價值明確[5-6]。miR-30d-5p是miRNA家族的一員，在外周血中穩定存在，有學者通過生物信息學分析發現miR-30d-5p可能參與了ADHD的發生和發展[7]，但miR-30d-5p的表達量是否與ADHD患兒行為癥狀嚴重程度有關，尚未有研究報告。故本研究分析ADHD患兒外周血miR-30d-5p表達量與其行為癥狀的關系，以期為ADHD的臨床診斷和病情評估提供新型生物學指標。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年2月至2021年4月本院收治的108例ADHD初診患兒為觀察組，另選取同期健康體檢的110例健康兒童為對照組。納入標準：(1)觀察組患兒均符合ADHD的診斷標準[8]；(2)對照組兒童均經全面體檢確認健康；(3)年齡6～16歲；(4)韋氏兒童智力量表[9]測評智商≥80分；(5)研究對象的監護人均對本研究知情，且均簽署知情同意書。排除標準：(1)合并人格障礙、精神分裂癥、抑郁癥等精神疾病者；(2)合并腦外傷、腦血管疾病或神經系統器質性疾病者；(3)合并嚴重的心、腎、肝疾病者；(4)接受過精神藥物或物理治療者；(5)藥物依賴者。觀察組中男童81例、女童27例，患兒年齡6～15(10.29±2.04)歲，體質指數13.68～20.97(17.24±3.19)kg/m2；注意缺陷型29例，多動沖動型13例，混合型66例；智商評分為80～116(93.78±10.41)分。對照組中男童75例、女童35例，兒童年齡6～16(10.73±1.98)歲，體質指數13.49～21.15(17.53±3.26)kg/m2，智商評分為80～118(95.02±11.28)分。兩組性別、年齡、體質指數、智商評分對比，差異均無統計學意義(均P>0.05)。本研究已通過成都市婦女兒童中心醫院醫學倫理委員會的批準(批準編號：201901-003)。

1.2 外周血miR-30d-5p的檢測 于對照組兒童體檢當天、于觀察組患兒入院第2天，采集其空腹靜脈血樣5 mL，在4 ℃、3 000 r/min條件下離心10 min后取上清液，按照TRIzolTM試劑盒(美國Invitrogen公司，批號：284906、3018305)說明書提取總RNA，并采用CFX96實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)、反轉錄試劑盒(北京天根生化科技有限公司，批號：U8707、W9520)進行反轉錄合成cDNA。以U6為內參基因，采用CFX96實時熒光定量PCR儀進行擴增。其中miR-30d-5p上游引物序列為5′-CTTTGGTCCCCTTCAACCA-3′，下游引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應體系：10倍miRNA混合物10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，cDNA 2 μL，RNase-free H2O加至20 μl；PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，54 ℃ 40 s，70 ℃ 20 s，循環45次。采用2-ΔΔCt法計算miR-30d-5p的相對表達量。

1.3 行為癥狀的評估 于觀察組患兒入院當天，采用Conners父母癥狀問卷[10]評估其行為癥狀，由家長填寫問卷。該問卷包括品行問題、學習問題、身心問題、焦慮、多動沖動及多動指數6個因子共48個條目，每個條目0～3分，分數越高代表癥狀越嚴重。

1.4 統計學分析 采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析。對計量資料進行正態檢驗，符合正態分布的資料以(x±s)表示，采用t檢驗或方差分析進行組間比較，不符合正態分布的計量資料則采用[M(P25，P75)]表示；計數資料以例數(百分比)描述，采用χ2檢驗進行組間比較；采用Spearman法分析ADHD患兒外周血miR-30d-5p表達量及其與行為癥狀評分的關系。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組外周血miR-30d-5p表達量的比較 觀察組的外周血miR-30d-5p表達量低于對照組(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組外周血miR-30d-5p相對表達量的比較(x±s)

2.2 觀察組ADHD不同亞型患兒外周血miR-30d-5p表達量比較 觀察組ADHD不同亞型患兒的外周血miR-30d-5p表達量差異均有統計學意義(P<0.05)，其中混合型患兒的外周血miR-30d-5p表達量低于注意缺陷型患兒(P<0.05)，而注意缺陷型和多動沖動型患兒之間差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3 觀察組患兒的行為癥狀評分及其與外周血miR-30d-5p表達量的關系 觀察組患兒的品行問題、學習問題、身心問題、焦慮、多動沖動及多動指數評分分別為23.59(18.48，27.23)分、10.46(8.11，13.12)分、6.08(4.68，7.41)分、5.10(3.87，6.19)分、8.55(7.38，10.40)分、20.78(17.04，25.15)分。觀察組患兒的外周血miR-30d-5p表達量與其品行問題、學習問題、身心問題、焦慮、多動沖動及多動指數評分均呈負相關(均P<0.05)，見表3。

表3 觀察組患兒外周血miR-30d-5p表達量與其行為癥狀評分的相關性

3 討 論

ADHD的病因和發病機制比較復雜，目前仍不明確。但多數學者認為環境因素、遺傳因素、心理因素均與ADHD的發生、發展關系密切，均可能增加ADHD的發生風險[11-13]。ADHD患兒存在注意力渙散、活動過度、任性、沖動等行為，多表現為注意選擇性差和范圍狹窄、注意維持困難、不善于轉移分配注意力等，因受以上核心癥狀的影響，患兒對新事物的認知和對知識的理解記憶能力明顯不足，缺乏對刺激的敏感性和覺醒度，這常導致患兒出現學習困難及適應能力差，進而出現恐懼、逃避、焦慮等情緒問題[14-15]。本研究通過Conners父母癥狀問卷評估ADHD患兒的行為癥狀，發現其品行問題、學習問題、身心問題、焦慮、多動沖動及多動指數方面的行為癥狀評分均較高，表明ADHD患兒存在較嚴重的行為問題，需盡早明確診斷以指導臨床治療。目前臨床主要依據量表評估ADHD患兒行為癥狀從而進行診斷、分型、治療，但量表評估問卷多由患兒父母進行填寫，可能存在夸張或掩飾的現象，具有一定的主觀性，且受父母年齡、文化因素影響，不能很準確地判斷患兒的病情，影響患兒臨床診斷和治療[16-17]，故亟需尋找具有診斷價值的ADHD分子標志物。

本研究結果顯示，觀察組外周血miR-30d-5p表達量低于對照組，其中混合型患兒的外周血miR-30d-5p表達量低于注意缺陷型患兒(P<0.05)，說明ADHD患兒外周血miR-30d-5p表達水平較正常兒童下調，且不同亞型的ADHD患兒外周血miR-30d-5p表達水平存在一定的差異。既往研究報告，miRNA在神經系統中含量豐富，參與神經新陳代謝、軸突形成等多種生物學過程，參與多種精神性疾病的發生[18-19]。朱萍等[20]通過基因芯片篩選技術及PCR驗證，發現與正常兒童相比，miR-30d-5p在ADHD患兒外周血中表達量降低，這與本研究結果相似，提示miR-30d-5p表達下調可能在ADHD的發病中起一定作用。miR-30d-5p序列具有高度保守性，其調控的靶基因可定位到細胞膜、細胞器、核質、軸突等結構，并參與神經元的發育、分化、順式調控區結合、神經信號轉導等過程，其表達下調可影響神經的退行性病變、凋亡、再生和發育[21-22]，進而促使ADHD發生。

此外，本研究結果顯示，觀察組患兒外周血miR-30d-5p表達量與其品行問題、學習問題、身心問題、焦慮、多動沖動及多動指數評分均呈負相關(均P<0.05)，表明ADHD患兒外周血miR-30d-5p的表達情況與其行為癥狀嚴重程度有密切相關性，臨床或可通過檢測外周血miR-30d-5p表達量來判斷ADHD患兒的行為癥狀程度。張帆等[23]發現，治療前后ADHD患兒miRNA(miR-4655-3p和miR-7641)的表達量和癥狀會發生變化，且二者存在顯著的相關性，這與本研究結果觀點相符，說明miRNA可能通過某種途徑影響患兒的臨床癥狀。孫加雯等[7]將miR-30d-5p的靶基因與基因數據庫中ADHD相關性基因進行比對后發現，miR-30d-5p中有33個靶基因參與了ADHD的發病機制，其可調控神經的發育、軸突導向、信號傳導通路，筆者推測miR-30d-5p可能通過ADHD相關靶基因的作用來影響患兒的癥狀。

綜上所述，ADHD患兒外周血miR-30d-5p表達較正常兒童降低，且與患兒的行為癥狀嚴重程度相關。因此，miR-30d-5p有可能作為臨床診斷ADHD的分子指標之一。但由于本研究樣本量有限，需進一步擴大樣本量驗證本研究結果的準確性。