指紋圖譜結(jié)合一測(cè)多評(píng)法評(píng)價(jià)文冠木藥材的質(zhì)量Δ

李珍，楊洋，徐萌杰，金一荻（.鄂爾多斯市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 0700；.鄂爾多斯市疾病防控中心，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 0700）

文冠木的蒙藥名為“森登”，為無(wú)患子科植物文冠木Xanthoceras sorbifoliaBunge莖桿或枝條的干燥木部，是蒙、藏醫(yī)常用藥材。該藥味甘、澀、微苦，性動(dòng)、涼、燥，具有燥“協(xié)日烏素”、消腫、清熱、止痛之功效[1]。文冠木含有大量的黃酮類、三萜類、酚酸類等成分[2]，其中沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、楊梅素、二氫楊梅素、表兒茶素、兒茶素、花旗松素等黃酮類成分是其主要化學(xué)成分[3-4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，上述黃酮類成分具有抗炎、保護(hù)胃黏膜等活性[5-6]。在臨床實(shí)踐中，文冠木常以單方或復(fù)方的形式用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、皮膚風(fēng)濕病等疾病的治療[3，7-9]。

《內(nèi)蒙古蒙藥材標(biāo)準(zhǔn)》僅對(duì)文冠木的性狀和顯微鑒別進(jìn)行了規(guī)定[10]，難以全面反映其內(nèi)在和整體質(zhì)量，也無(wú)法評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地藥材間的差異。蒙藥成分復(fù)雜，療效是多種成分共同作用的結(jié)果，故學(xué)者將研究重點(diǎn)放到了基于多種活性成分含量測(cè)定的質(zhì)量控制方面[11-12]。然而，多指標(biāo)的定量測(cè)定受限于對(duì)照品種類多、獲取難度大。一測(cè)多評(píng)（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）法能以單一對(duì)照品同時(shí)測(cè)定多種成分的含量，指紋圖譜可較好地對(duì)民族藥進(jìn)行整體評(píng)價(jià)，二者有機(jī)結(jié)合可有助于評(píng)價(jià)民族藥的整體質(zhì)量，具有較高的實(shí)用性和經(jīng)濟(jì)性[13-14]。基于此，本研究擬建立文冠木的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并以表沒(méi)食子兒茶素（對(duì)照品易獲得且價(jià)格適中）為參照物采用QAMS法同時(shí)測(cè)定藥材中沒(méi)食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素、二氫楊梅素、花旗松素、楊梅素的含量，以期為該藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有1260型HPLC儀（美國(guó)Agilent公司）、AL201-IC型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

沒(méi)食子兒茶素對(duì)照品（批號(hào)M27FB114096，純度≥98%）、表沒(méi)食子兒茶素對(duì)照品（批號(hào)K22N9R75650，純度≥98%）、楊梅素對(duì)照品（批號(hào)YM0311YA13，純度≥98%）、二氫楊梅素對(duì)照品（批號(hào)Y26D10K106736，純度≥98%）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；表兒茶素對(duì)照品（批號(hào)110878-201703，純度99.7%）、兒茶素對(duì)照品（批號(hào)110877-202005，純度95.1%）、花旗松素對(duì)照品（批號(hào)110816-201102，純度98.9%）、槲皮苷對(duì)照品（批號(hào)111538-201105，純度92.7%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

文冠木藥材（編號(hào)S1～S11用于指紋圖譜，編號(hào)S1～S16用于含量測(cè)定）經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院拉喜那木吉拉教授鑒定為無(wú)患子科植物文冠木X.sorbifoliaBunge莖桿或枝條的干燥木部，其具體來(lái)源信息見(jiàn)表1。

表1 文冠木藥材樣品的來(lái)源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以Agilent 5TC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～15 min，5%A～12%A；15～25 min，12%A～18%A；25～40 min，18%A～35%A；40～45 min，35%A；45～46 min，35%A～5%A；46～52 min，5%A）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；進(jìn)樣量為2 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、楊梅素、二氫楊梅素、表兒茶素、兒茶素、花旗松素、槲皮苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋，制成上述成分質(zhì)量濃度分別為72.4、68.8、107.2、89.6、69.6、106.8、99.6、90.4 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，再取10 mL置于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得混合對(duì)照品溶液Ⅰ。分別精密稱取除槲皮苷外的其余7種對(duì)照品適量，同法制成質(zhì)量濃度分別為1 007.4、1 012.4、1 015.7、1 022.8、1 020.2、1 014.6、1 015.1 μg/mL的混合對(duì)照品溶液Ⅱ。

2.2.2 供試品溶液 取文冠木藥材粉末（過(guò)40目篩，下同）約0.5 g，精密稱定，加75%乙醇100 mL、稀鹽酸1 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，冷卻至室溫后，再次稱定質(zhì)量，用75%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3 HPLC指紋圖譜的建立

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S3），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。以表沒(méi)食子兒茶素峰（峰形好且峰面積相對(duì)較大）為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n＝6），說(shuō)明方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S3），分別于4 ℃下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以表沒(méi)食子兒茶素峰為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n＝6），表明供試品溶液在4℃下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取文冠木樣品（編號(hào)S3），共6份，各約0.5 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以表沒(méi)食子兒茶素峰為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n＝6），說(shuō)明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià) 分別取11批文冠木樣品（編號(hào)S1～S11），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖并將色譜信息導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）》，以S1樣品圖譜（色譜信息相對(duì)豐富）為參照，經(jīng)多點(diǎn)校正、全峰匹配后，得11批樣品的對(duì)照指紋圖譜（R）和疊加指紋圖譜（圖1）。通過(guò)比對(duì)混合對(duì)照品溶液Ⅰ的色譜圖（圖2），共指認(rèn)了7個(gè)成分，其中峰1為沒(méi)食子兒茶素，峰2為表沒(méi)食子兒茶素，峰3為兒茶素，峰5為表兒茶素，峰6為二氫楊梅素，峰14為花旗松素，峰15為楊梅素（雖有文獻(xiàn)指出文冠木藥材中含有槲皮苷[11]，但本文并未指認(rèn)出該成分）。11批樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度分別為 1.000、0.999、0.998、0.998、0.912、0.923、0.928、0.919、0.957、0.926、0.910，均 大于0.9。

圖1 11批文冠木樣品的對(duì)照指紋圖譜（R）和疊加指紋圖譜

圖2 混合對(duì)照品溶液Ⅰ的色譜圖

2.4 聚類分析

以7個(gè)已指認(rèn)共有峰峰面積與取樣量的比值為變量，以?shī)A角余弦為距離，采用SPSS 28.0軟件對(duì)11批文冠木樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果（圖3）顯示，當(dāng)以距離2為判別條件時(shí)，11批文冠木被分為4類，S5～S7、S9為一類，S8、S11為一類，S10為一類，S1～S4為一類。

圖3 11批文冠木樣品的聚類分析樹(shù)狀圖

2.5 主成分分析

將11批文冠木中7個(gè)已指認(rèn)共有峰的峰面積導(dǎo)入SPSS 28.0軟件，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行主成分分析。本研究提取對(duì)應(yīng)特征值排名前3位的主成分，其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)99.24%，提示其包含了大部分的色譜信息。這3個(gè)主成分的特征值分別為6.438、0.399、0.110，方差貢獻(xiàn)率分別為91.97%、5.70%、1.57%。以這3個(gè)主成分為坐標(biāo)系構(gòu)建得分圖（圖4），結(jié)果顯示，11批文冠木可分為4類，S5～S7為一類，S8～S11一類，S3、S4為一類，S1、S2為一類。

圖4 11批文冠木樣品的主成分分析得分圖

2.6 黃酮類成分定量分析的方法學(xué)考察

采用同一HPLC法測(cè)定文冠木中沒(méi)食子兒茶素等7種已指認(rèn)黃酮類成分的含量。方法學(xué)考察內(nèi)容如下：2.6.1 專屬性考察 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液Ⅰ、“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S8）和空白溶劑（甲醇）各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜圖（圖略）。結(jié)果顯示，上述7種成分色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于3，理論板數(shù)均大于50 000，空白溶劑對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，說(shuō)明方法專屬性良好。

2.6.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液Ⅱ 0.25、0.5、1、2、3、4、8 mL，置于100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成各成分質(zhì)量濃度均分別約為2.5、5、10、20、30、40、80 μg/mL的線性溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以待測(cè)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積平均積分值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 沒(méi)食子兒茶素等7種待測(cè)成分的回歸方程與線性范圍

2.6.3 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批文冠木樣品（編號(hào)S3），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次考察方法精密度；平行制備供試品溶液6份，考察方法重復(fù)性；于4℃下放置12 h，考察穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD均小于3%。

2.6.4 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的文冠木樣品（編號(hào)S3），共9份，每份約0.25 g，精密稱定，加入“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液Ⅱ適量（加入量與已知量的質(zhì)量比約為1∶0.5、1∶1、1∶1.5），用 75% 乙醇定容至 100 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素、二氫楊梅素、花旗松素、楊梅素的平均加樣回收率分別為100.84%、98.25%、100.61%、98.69%、101.67%、100.28%、103.25%，RSD均小于2%（n＝9）。

2.7 黃酮類成分定量分析QAMS法的建立

2.7.1 相對(duì)校正因子的確定 吸取“2.6.2”項(xiàng)下各成分質(zhì)量濃度均約為20 μg/mL的線性溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣1、2、4、6、8 μL，每個(gè)進(jìn)樣量平行6次，記錄峰面積并按下式分別計(jì)算不同進(jìn)樣量下沒(méi)食子兒茶素（A）、兒茶素（B）、表兒茶素（C）、二氫楊梅素（E）、花旗松素（F）和楊梅素（G）相對(duì)于參照物表沒(méi)食子兒茶素（D）的相對(duì)校正因子（fs/j）：fs/j＝fs/fj＝（As/cs）/（Aj/cj）（式中，fs/j為參照物s對(duì)待測(cè)成分j的校正因子，As為參照物s的峰面積，cs為參照物s的質(zhì)量濃度，Aj為某待測(cè)成分j的峰面積，cj為某待測(cè)成分j的質(zhì)量濃度），結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分的相對(duì)校正因子（n＝6）

2.7.2 不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響 考察不同色譜柱[Agilent 5TC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Tna-ture C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Shim-pack GIST C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]對(duì)沒(méi)食子兒茶素等6種待測(cè)成分相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果顯示，在不同色譜柱條件下，各成分相對(duì)校正因子的RSD均小于2%（n＝3），提示色譜柱的變化對(duì)各成分相對(duì)校正因子的影響不明顯。

2.7.3 不同溫度對(duì)相對(duì)校正因子的影響 考察不同柱溫（25、30、35℃）對(duì)沒(méi)食子兒茶素等6種待測(cè)成分相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果顯示，在不同柱溫條件下，各成分相對(duì)校正因子的RSD均小于2%（n＝3），提示溫度的變化對(duì)各成分相對(duì)校正因子的影響不明顯。

2.8 黃酮類成分不同定量方法測(cè)定結(jié)果的比較

稱取16批文冠木樣品（編號(hào)S1～S16），分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，分別采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法、QAMS法、外標(biāo)一點(diǎn)（one point external standard method，ESM）法測(cè)定文冠木中沒(méi)食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素、二氫楊梅素、花旗松素、楊梅素的含量并進(jìn)行比較。結(jié)果（表4）顯示，除楊梅素（RSD為11.16%～27.27%）和部分批次的兒茶素（S12、S14～S16樣品的RSD為4.36%～9.12%）外，其余成分3種方法的測(cè)定結(jié)果基本一致（RSD均小于4%）。

表4 16批文冠木樣品中6種成分的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 指紋圖譜分析

本研究建立了11批文冠木藥材的HPLC指紋圖譜，確定了15個(gè)共有峰，并指認(rèn)了其中7個(gè)成分；各批樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度為0.910～1.000，其中內(nèi)蒙古阿拉善和河北安國(guó)市產(chǎn)藥材的相似度均較高（為0.998～1.000），與內(nèi)蒙古呼和浩特市、通遼市產(chǎn)藥材的差異性較大；此外，通遼市產(chǎn)藥材的相似度為0.910～0.957，跨度較大，提示同一產(chǎn)地的藥材可能存在一定差異。

3.2 聚類分析與主成分分析

聚類分析的結(jié)果基本呈現(xiàn)產(chǎn)地規(guī)律性，S5～S7批文冠木藥材均來(lái)自內(nèi)蒙古呼和浩特市，S8、S11批文冠木藥材均來(lái)自內(nèi)蒙古通遼市，S1、S2批文冠木藥材均來(lái)自內(nèi)蒙古阿拉善盟，S3、S4批文冠木藥材均來(lái)自河北安國(guó)市，說(shuō)明不同產(chǎn)地的文冠木藥材具有一定的差異性，但個(gè)別產(chǎn)地的藥材也具有一定的相似性，這與相似度評(píng)價(jià)的結(jié)果基本一致。

主成分分析的分類情況與文冠木的產(chǎn)地分布基本吻合：S5～S7批文冠木藥材均來(lái)自內(nèi)蒙古呼和浩特市，S8～S11批文冠木藥材均來(lái)自內(nèi)蒙古通遼市，S1、S2批文冠木藥材均來(lái)自內(nèi)蒙古阿拉善盟，S3、S4批文冠木藥材均來(lái)自河北安國(guó)市。該結(jié)果與聚類分析結(jié)果有所不同，這可能與兩種分析方法所采用的變量不同有關(guān)。

3.3 含量測(cè)定結(jié)果分析

中藥、民族藥成分復(fù)雜，具有多成分和多靶點(diǎn)特點(diǎn)，僅用一種成分無(wú)法全面表征其質(zhì)量的優(yōu)劣，而多成分檢測(cè)因?qū)φ掌凡灰撰@得、成本高，溶液配制耗時(shí)長(zhǎng)、產(chǎn)生廢液多等不足而導(dǎo)致檢測(cè)成本攀升。本研究以表沒(méi)食子兒茶素為參照物建立了QAMS法，同時(shí)分析了其與ESM法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測(cè)結(jié)果的差異。結(jié)果顯示，除楊梅素和部分批次的兒茶素外，其余成分含量的RSD均在4%以內(nèi)，基本實(shí)現(xiàn)了以單一對(duì)照品同時(shí)測(cè)定文冠木藥材中沒(méi)食子兒茶素、表兒茶素、二氫楊梅素和花旗松素的含量。但值得注意的是，因不同方法測(cè)定結(jié)果差異較大，有效成分兒茶素、楊梅素不宜采用QAMS法檢測(cè)。

綜上所述，所建HPLC指紋圖譜和含量測(cè)定方法可行，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別分析可用于文冠木藥材的質(zhì)量控制；QAMS法可用于測(cè)定其中沒(méi)食子兒茶素、表兒茶素、二氫楊梅素、花旗松素的含量。