花生HSP 20基因家族鑒定及其表達特性分析

姜煥煥，張嘉敏，何洪活，李麗梅，吳倩盈，黃 曉，王 通，

（1.肇慶學院 生命科學學院，廣東 肇慶 526061；2.山東省花生研究所，山東 青島 266100）

熱激蛋白（Heat shock protein，HSP）是一類植物受不良環境脅迫后，大量表達以減輕逆境脅迫損傷的保護性蛋白.按照分子量大小可分為5類：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP20.其中HSP20分子量在12~42 kDa之間，是一類受逆境脅迫后迅速合成的小分子熱激蛋白，以基因家族的形式存在于植物染色體中[1-2].HSP20基因家族分析已在多種作物中展開研究.擬南芥中鑒定出19個HSP20基因家族成員[3]，白菜中有27個HSP20基因家族成員[4]，辣椒中有35個HSP20基因家族成員[5]，在小麥和大麥中共發現40個HSP20基因家族成員[6].根據基因的細胞位置，序列同源性和基因功能分為多個亞家族.其中擬南芥HSP20基因家族分為12個亞族，分別為：CI、CII、CIII、CIV、CV、CVI、CVII定位于細胞質或細胞核；MI、MII定位在線粒體；P定位于質體；PO定位于過氧化物酶體；ER定位于內質網[7].此外，關于HSP20基因家族的表達模式在多種作物中展開了研究.張寧等人[8]對番茄HSP20基因家族研究表明，其存在多個順式作用元件，參與番茄逆境脅迫響應.孫宇棟等人[9]研究核桃的HSP20基因對溫度脅迫響應的分子調控機理，結果表明核桃JrHSP20-1基因能夠顯著提升轉基因酵母對高溫和低溫的耐受能力.郭猛[10]對辣椒CaHSP20基因家族的研究，表明其受逆境脅迫響應上調表達.植物HSP20基因沒有單一表達模式，同一HSP20基因亞家族的成員也沒有相同的表達模式.多種生物及非生物（高溫、低溫、干旱）脅迫能夠誘導HSP20基因表達.

花生是我國重要的油料作物之一，其生長及品質受逆境脅迫影響.與栽培種相比，野生種花生具有較強的抗逆性.因此，全面鑒定和分析野生種花生HSP20基因家族結構與功能，對揭示其在花生生長發育過程及逆境脅迫響應的分子機理方面具有重要意義.野生種花生A.duranensis和A.ipaensis的全基因測序已完成，使得在全基因組水平挖掘和鑒定HSP20基因家族成員成為可能[11].本研究基于此基礎，運用生物信息學方法對野生花生全基因組序列進行挖掘，鑒定全部HSP20基因家族成員，并對其染色體定位、系統發育關系、基因結構和表達特性進行分析，為研究花生HSP20基因家族的功能和抗脅迫反應機理提供了支持.

1 材料與方法

1.1 花生HSP 20基因的檢索與鑒定

從Pfam（http:∕∕pfam.xfam.org∕）數據庫中獲得HSP20基因家族隱馬爾可夫模型文件，再利用HMMER3.0軟件對野生花生A.duranensis（Aradu.V14167.a1.M1）和A.ipaensis（Araip.K30076.a1.M1）的蛋白質組數據庫進行搜索.將搜索到的HSP20基因序列提交到在線工具NCBI（Conserved Domain Search）和Pfam數據庫中，進一步鑒定是否含有HSP20蛋白結構域.從花生基因組數據庫（http:∕∕peanutbase.org∕）上獲得基因信息.利用在線網站ProtParam（http:∕∕www.expasy.org∕）分析HSP20蛋白的理化性質.

1.2 花生HSP 20基因家族進化分析

從擬南芥數據庫中下載HSP20基因組序列.將檢索到的A.duranensis和A.ipaensis的HSP20基因組序列保存為FASTA格式，用ClustalW軟件進行多序列比對，MEGA7.0軟件鄰接法（Neighbor-Joining Joining）進行系統化樹的構建.

1.3 花生HSP 20基因染色體定位分析

從Peanutbase（http:∕∕peanutbase.org∕）數據庫中查找花生HSP20基因位置及各條染色體長度，利用軟件MapInspect繪制染色體定位圖.

1.4 花生HSP 20基因結構和保守基序預測

從Peanutbase（http:∕∕peanutbase.org∕）數據庫下載AdHSP20基因和AiHSP20基因的編碼區序列（CDS）和基因組序列，利用在線網站GSDS繪制蛋白結構圖.采用MEME（http:∕∕meme-suite.org∕）在線工具對該基因家族的基序（Motif）進行預測，發現基序最多值設置為5，其余不做改動.

1.5 花生HSP 20基因家族表達特性分析

從花生基因組數據庫中下載野生種花生RNA-Seq測序的基因表達數據（https:∕∕www.peanutbase.org∕gene_expression）.利用hemI軟件將對HSP20基因家族在花生不同組織器官的表達模式進行聚類分析并繪制熱圖.

1.6 花生HSP 20基因家族上游調控序列分析

在Peanutbase數據庫中獲得HSP20基因的NCBI編號，將NCBI編號逐一提交到NCBI在線軟件中，找出并下載每個基因的上游2 000 bp序列，利用軟件plantcare（http:∕∕bioinformatics.psb.ugent.be∕webtools∕plantcare∕html∕）進行順式作用元件分析.

2 結果與分析

2.1 花生HSP 20家族基因的鑒定及特性分析

通過HMMER軟件搜索花生基因組數據庫和進一步的結構域確認，共鑒定出AdHSP20基因和AiHSP20基因各27個.根據染色體定位信息分別命名為AdHSP20-1～AdHSP20-27和AiHSP20-1～AiHSP20-27.在PeanutBase數據庫中獲得HSP20基因的基本信息，并利用ProtParam分析HSP20蛋白的等電點和分子量，結果如表1和表2所示.AdHSP20基因長度差異很大，最短的是AdHSP20-4（438 bp），最長的是AdHSP20-5（7 896 bp）；其中，13個AdHSP20家族成員的等電點在4.77～6.93，14個AdHSP20家族成員的等電點在7.74～9.74；其分子量為14 194.11～74 147.53 D.AiHSP20基因家族基因長度為946 bp~1 103 bp.AiHSP20蛋白組成大多數為酸性氨基酸，氨基酸長度在110~2 062 Aa之間.其分子量的最小值35 791.87 Da（AiHSP20-8），最大值是1 230 785 Da（AiHSP20-23）.

表1 野生種花生A.duranensis的HSP 20基因信息

表2 野生種花生A.paensis的HSP 20基因信息

2.2 花生HSP 20基因家族進化分析

下載擬南芥HSP20基因序列并和野生花生HSP20基因家族成員進行系統進化分析（圖1）.結果可以看出，花生HSP20的基因家族成員與擬南芥HSP20基因同源性程度較高.27個AdHSP20基因家族分為4個亞家族，每個亞家族數量不等.其中20個AdHSP20基因（74.07%）定位在細胞核（C），4個AdHSP20基因（14.81%)定位于線粒體（M），2個AdHSP20基因（7.41%）定位于過氧化物酶體（PO），1個AdHSP20基因（3.70%）定位在質體（P），沒有定位在內質網（ER）中的基因.AiHSP20基因家族分為11個亞族，其中內質網（ER）有1個基因，質體（P）有2個基因，線粒體（MII）有1個基因，線粒體（MI）有2個基因，除了細胞核（CII）含有2個基因外，CIII、CVI、CVII分別含有1個基因，而CI有6個基因.

圖1 花生HSP 20基因家族系統進化關系分析

2.3 HSP 20基因家族染色體定位分析

分析HSP20基因家族染色體定位信息，繪制染色體定位圖（圖2）.從圖中可以看出，27個AdHSP20基因隨機分布在1到9號染色體上，其中，5號染色體上只有1個AdHSP20成員，1、4、9和10號染色體上各有2個AdHSP20成員，2和3號染色體上存在3個AdHSP20成員，8號染色體上有5個成員，7號染色體上分布最多，為7個AdHSP20成員.存在4對串聯重復序列（AdHSP20-14∕AdHSP20-15，AdHSP20-14∕AdHSP20-15∕AdHSP20-16，AdHSP20-17∕AdHSP20-18，AdHSP20-19∕AdHSP20-20）.AiHSP20基因家族成員分布在9條染色體的不同位置上.7號染色體包含9個基因，5號染色體包含1個基因，1號和4號染色體包含3個基因，2、6、9和10號染色體各包含2個基因.存在2對串聯的重復序列（AiHSP20-21∕AiHSP20-22∕AiHSP20-23，AiHSP20-26∕AiHSP20-27）.

圖2 HSP 20基因家族染色體定位分析

2.4 花生HSP 20基因家族結構及保守基序分析

HSP20基因家族的內含子-外顯子及其保守基序分析如圖3所示.在27個AdHSP20基因中，6個基因不含內含子，15個基因含有1個內含子，其余基因家族成員含有2~10個內含子.AdHSP20基因家族含有的外顯子數目差距比較大，只含有1個外顯子的基因家族成員有6個，含有2個外顯子（CDS）的成員最多，多達15個，6個成員的外顯子數在3~11之間.花生AiHSP20基因家族外顯子的數量通常為2個，而AiHSP20-8基因僅包含1個外顯子；其余基因包含有3至7個；AiHSP20-5和AiHSP20-21基因含有12個外顯子；AiHSP20-25為17個.保守基序結果顯示，在27個AdHSP20基因家族成員中，除了AdHSP20-14和AdHSP20-23這2個家族成員無Motif外，其他都有1至4個Motif，其中4個AdHSP20家族成員只有1個Motif，12個AdHSP20基因家族成員有2個Motif，7個AdHSP20基因家族成員有3個Motif，2個AdHSP20基因家族成員有4個Motif.Motif1和Motif2存在于大部分AiHSP20基因中，只有AiHSP20-18、AiHSP20-19和AiHSP20-20存在Motif3、Motif4和Motif5；AiHSP20-3、AiHSP20-5、AiHSP20-10只存在Motif1而AiHSP20-4、AiHSP20-14沒有基序.從圖中還可以看出有21個AdHSP20基因家族成員同時含有Motif1和Motif2，通過對比可以發現，親緣關系越相近的基因家族成員，其Motif分布的數量和位置也越相同.這些結果表明這27個AdHSP20基因家族成員可能具有相對較高的保守性.

圖3 花生HSP 20基因家族結構與進化分析

2.5 花生HSP 20基因家族組織表達特性

以花生野生種22個組織中基因表達數據為基礎，提取HSP20基因相關數據，進行組織表達模式分析，結果如圖4所示.可以看出，HSP20基因家族在花生的22個組織中表達情況不同.大部分基因在花及種子的不同發育時期表達量低.Aradu.EM2UC，Araip.KV8CW，Araip.SBC75，Aradu.BGMOC，Araip.96WUD，Aradu.VOJK3，Aradu.4G8YD，Aradu.L4J2W，Araip.J4RXP，Aradu.BJ6ZM，Arai p GC3C4，Araip.9ZW22，Aradu.Z42XR，Araip.E6U9Y，Aradu.SJ2KY，Aradu WLIAY在22個組織中表達量低.其中，Araip.WTB7G僅在根中低表達，Aradu.BJ6ZM僅在雌蕊中表達，Araip.IW5F0基因在所有組織中都無表達.2個野生種花生中各有5個基因在22個組中高表達.其中，A.duranensis中高表達基因為AdHSP20-7（Aradu.XVU7P），AdHSP20-8（Aradu.XQ3RE），AdHSP20-17（Aradu.RYN4L），AdHSP20-20（Aradu.WH8HR），AdHSP20-24（Aradu.65PX4）；A.ipaensis中在各組織表達量較高的基因分別為AiHSP20-6（Araip.PRK60），AiHSP20-7（Araip.E15FG），AiHSP20-15（Araip.VGJ9R），AiHSP20-16（Araip.T9454），AiHSP20-25（Araip.KY2NA）.

圖4 HSP 20基因家族的組織表達情況分析

2.6 花生HSP 20基因家族成員上游調控序列分析

研究分別對27個AdHSP20和AiHSP20基因的啟動子區進行檢索，查找其存在的參與脅迫基因的順式作用元件，結果如表3和表4所示.由表中可以看出，不同HSP20基因家族成員的順式作用元件種類和數目存在差異.主要有激素應答元件和逆境脅迫應答元件這2大類.激素應答元件有ABA應答元件（ABRE）、生長素應答元件（AuxRR-cor∕TGA-element）、乙烯應答元件（ERE）、赤霉素應答元件（GARE-motif∕P-box∕TATC-box）、水楊酸應答元件（TCA-element）和茉莉酸甲酯應答元件（CGTCA-motif∕TGACG-motif）這6種.其中，22個AdHSP20因含有ABA應答元件，17個AdHSP20基因含有1至4個生長素順式作用元件.逆境脅迫應答有LTR（低溫脅迫應答元件）、MBS（干旱脅迫應答元件，WUN motif（傷害應答元件）和TC-rich repeats（防御與脅迫應答元件）這4種.其中，13個AdHSP20基因家族成員含有低溫脅迫應答元件和干旱脅迫應答元件，7個AiHSP20基因具有低溫脅迫元件（LTR），20個AiHSP20基因具有干旱脅迫應答元件（MBS），其中AiHSP20-4含有最多MBS元件（3個）；7個AiHSP20基因具有WUN-motif（7個），12個AiHSP20基因具有TC-rich repeats，其中AiHSP20-2含有2個.說明HSP20在花生生長發育及響應逆境脅迫中起到了重要作用.

表3 AdHSP 20基因啟動子區順式作用元件種類及個數

表4 AiHSP 20基因家族啟動子區順式作用元件分析

3 討論

HSP20是一類廣泛存在于植物中的小分子熱激蛋白，在植物受到不良環境，比如低溫、高溫、干旱、鹽、氧化等脅迫后迅速大量合成.野生花生具有較強的抗逆性和抗病性，但其HSP20基因家族分析還未見報道.本研究利用生物信息學方法對2個野生種花生HSP20基因家族進行挖掘鑒定，發現2個野生種各有27個HSP20基因家族成員.比擬南芥（19個），白菜（27個），辣椒（35個）中的基因家族成員多[3-5].花生HSP20蛋白多數為酸性氨基酸，與壇紫菜HSP20蛋白的分析結果一致[12].這些基因多數定位于細胞核或者細胞質中，定位于內質網、線粒體、質體、過氧化物酶體的HSP20基因成員只有少數，這與張寧等人[8]對番茄HSP20基因家族成員分析結果一致.Scharf等[3]對擬南芥19個HSP20基因家族成員的研究表明，定位在細胞核或細胞質中的基因有13個，定位于內質網、線粒體、質體、過氧化物酶體的基因有6個；Sarkar等[13]對水稻的23個HSP20基因家族成員的分析表明，分布在細胞核或者細胞質中的有16個基因，定位于內質網、線粒體、質體、過氧化物酶體的有7個基因.說明HSP20家族基因間存在多樣性，這為進一步深入研究HSP20基因功能提供了理論基礎.

本研究對野生種花生HSP20基因結構，基因位置，系統發育關系和保守基序研究結果顯示，基因結構不同，內含子個數多數為0到1個，且長度比較短.這與Mattick等[14]研究的植物傾向于保留無內含子或者長度較短的內含子基因一致.何福林等人[15]研究表明，銀杏HSP20基因的每個亞家族中成員均具有相似的分布特征.同時，對其染色體分布研究表明，花生中HSP20基因家族存在著多對串聯重復序列.親緣關系越相近的HSP20基因家族成員，其Motif分布的數量和位置也越相同.這些結果表明該基因家族在進化進程中高度保守.

多種生物及非生物（高溫、低溫、干旱）脅迫能夠誘導HSP20基因上調表達，其啟動子上游調控序列對其表達水平發揮著重要作用[16-17].花生在不同生長發育階段受干旱等逆境脅迫，影響著花生的品質和產量.本研究在對HSP20基因啟動子順式作用元件分析結果表明，其存在逆境脅迫應答元件，大多數HSP20基因家族成員含有低溫、干旱脅迫應答元件、傷害應答元件與防御與脅迫應答元件.初步推測該基因參與花生抵抗低溫脅迫和干旱脅迫反應.鄧立新等人[18]克隆雙孢蘑菇的HSP20基因并在擬南芥中表達，結果顯示，HSP20基因的表達增加了擬南芥的耐熱性.周亞東等人[19]研究表明，番茄HSP20基因受高溫脅迫表達量增加.另外，該基因還存在著大量的激素應答元件，表明其參與植物生長發育過程的調控.對該基因家族的組織表達特性分析結果也表明，HSP20基因家族具有組織表達特異性，且大部分基因在花生果針入土后開始大量表達.推測這些基因參與植物細胞內的一系列信號轉導和代謝過程，對調控花生生長過程發育起著重要作用.此外，每個基因具有多個響應元件，這說明花生中的HSP20基因家族的每個成員同時參與多個信號通路，因此下一步的主要任務是對HSP20基因的表達和調控差異及其調控機理的研究.

4 結論

HSP20是一類廣泛存在于植物中的小分子熱激蛋白，以基因家族的形式存在，在植物受到逆境脅迫后迅速大量合成.本研究利用生物信息學方法對花生全基因組序列挖掘，共鑒定出54個HSP20基因家族成員，進一步分析其理化性質、基因結構、系統進化關系、染色體定位和表達特性，可初步推測出該基因家族在花生抵抗非生物脅迫（低溫脅迫、干旱脅迫等）及植物生長發育過程中發揮著重要的作用，為將來深入研究花生HSP20功能奠定了基礎.