液態(tài)奶中的三聚氰胺檢測方法探討液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

葉夏聲，何玉榆，黃 婷，邱永為*

(1.深圳市質(zhì)量安全檢驗檢測研究院，廣東 深圳 518000；2.廣東省市場監(jiān)督管理局食用農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)管重點實驗室，廣東 深圳 518000)

三聚氰胺(melamine)(化學式為C3H6N6)，相對分子量為126.12，俗稱密胺、蛋白精，國際純化學和應用化學聯(lián)合會(international union of pure and applied chemistry chemical nomenclature，IUPAC) 命名為“1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺”，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物，是有機化工業(yè)的常用材料，廣泛應用于木材加工、化學涂料、高分子塑料等多個領域[1]。在傳統(tǒng)的檢測方法中，凱氏定氮法只能測定待測物的含氮量，進而推算出其蛋白質(zhì)的含量，忽略了氮元素的來源及種類，故被非法商家利用此漏洞將三聚氰胺添加至乳制品中，塑造蛋白質(zhì)含量高的假象。此類產(chǎn)品被人食用后會嚴重影響人的身體健康，長期食用可能會導致膀胱結(jié)石、腎結(jié)石、腎衰竭，泌尿系統(tǒng)未成熟的嬰幼兒食用后將會受到更大的影響，曾經(jīng)在社會上造成過惡劣影響[2]。在GB/T22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》中原料乳及乳制品中三聚氰胺的限量值分別為：嬰兒配方食品限量要求1.0 mg/kg；其他食品限量要求2.5 mg/kg[3]。故研究和開發(fā)出高效的三聚氰胺檢出分析技術(shù)一直是食品安全檢測領域的熱點。

常用的三聚氰胺檢測方法有酶聯(lián)免疫試劑盒檢測法(ELSAE)、膠體金試紙條法、氣相色譜-質(zhì)譜檢測法(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-gas chromatography/mass spectrometer，LC-MS/MS) 等[4-8]。其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法將色譜的高分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度和高選擇性優(yōu)點相結(jié)合，既可以定性又可以定量，應用前景廣闊[5-6]。本研究將基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)，對液態(tài)奶中三聚氰胺檢測方法進行進一步研究，優(yōu)化前處理步驟，用二乙胺乙腈水溶液作為提取液超聲提取液態(tài)奶中的三聚氰胺，離心后過濾，濾液無需凈化，用氮吹儀吹干，之后用甲醇進行復溶。該方法不僅免除了傳統(tǒng)方法中固相萃取的繁瑣步驟，消除牛奶基質(zhì)的影響，增強了抗干擾能力，還降低了檢出限，提高了定量檢測的重現(xiàn)性。整個前處理步驟較為簡單，節(jié)約了時間，降低了成本，實現(xiàn)了更快更準地測定液態(tài)奶中三聚氰胺的含量，為液態(tài)奶的安全食用提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 設備與試劑

1.1.1 儀器設備

試驗所用的安捷倫1290 液相色譜儀、AB Science 質(zhì)譜儀、氮吹儀、混合儀、梅特勒天平、旋渦混合器、冷凍離心機、超純水儀、超聲波清洗機購自相關生產(chǎn)廠家。

1.1.2 藥品與試劑

標準物質(zhì)：三聚氰胺(德國DR 公司生產(chǎn)，純度99.5%)

試劑：甲醇、二乙胺和乙腈均為德國默克產(chǎn)品(HPLC 級，純度≥98%)

復溶液：甲醇/水(v/v=20∶80)

1.2 樣品準備

取適量新鮮液態(tài)奶，于-20 ℃下避光保存。

1.3 標準儲備液和混合標準工作液的配制

準備三聚氰胺的標準品，精確稱取適量，用甲醇配成10 μg/mL 的標準儲備液，-18℃冰箱中保存，有效期6 個月；再分別移取適量地三聚氰胺標準儲備液，用甲醇逐級稀釋成適當濃度的三聚氰胺標準工作液。

1.4 樣品前處理

準確稱取2.00 g(±0.01 g) 試樣，置于15 mL 刻度試管中，加入7 mL 乙腈，使用渦旋儀振蕩1 min，后加入1 mL 二乙胺，用水定容至10 mL，渦旋振蕩1 min，超聲提取15 min，8 000 r/min 低溫離心8 min(4 ℃)，過濾后備用。移取2 mL 在80 ℃下氮氣吹干，用1 mL 的20%甲醇溶液復溶，裝瓶后供高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜上機測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線

按GB/T22388—2008 《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》中的條件設置儀器參數(shù)，配制一系列濃度的標準樣品溶液(0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.50 μg/mL)，待儀器平穩(wěn)后，對相應標準品溶液進行測定，繪制曲線，其相關系數(shù)R2=0.998 592，該曲線的R2值符合實驗要求。

2.2 檢出限測定

以空白牛奶樣品為基質(zhì)，一個陽性添加濃度C(10.0 μg/g)，按照上述優(yōu)化過的方法來前處理和上機，所得信噪比S/N=19.49，可計算檢出限為0.001 5 μg/g。計算公式如下：

檢出限(method detection limit，MDL)(μg/g)=3C/(S/N)

2.3 回收率和精密度的確定

以空白牛奶作為基質(zhì)，進行相應的加標回收試驗，加標濃度為10 μg/kg、50 μg/kg、200 μg/kg。每個加標濃度分別做6 個相同濃度的平行試樣，根據(jù)上述檢測方法進行前處理和儀器測定，方法精密度和回收率結(jié)果分別見表1、表2 所示。

3 結(jié)論

本研究探索優(yōu)化了一種基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的內(nèi)標法測定液態(tài)奶中三聚氰胺的分析方法。該方法通過用含10%二乙胺的乙腈水溶液充分提取，取上清液進行氮吹濃縮后，定容上機測定，最后，該方法的檢出限達到了0.001 5 μg/g，能靈敏的檢測低含量基質(zhì)，同時，液態(tài)奶試樣在按10 μg/kg、50 μg/kg、200 μg/kg 3 個濃度添加情況下，根據(jù)該試驗方法進行前處理和儀器檢測，結(jié)果回收率為87.79%～104.54%，相對標準偏差為2.39%～5.07%。該方法具有前處理簡單便捷、檢出結(jié)果精密度高、定量結(jié)果準確且重復測試較為穩(wěn)定等特點，大大提高了液態(tài)奶中三聚氰胺的檢測效率，方便對此類藥物的監(jiān)督管控，對有效的倒逼生產(chǎn)養(yǎng)殖端按規(guī)定使用該類藥物起到積極推動作用。