液相色譜-質(zhì)譜法高精準(zhǔn)檢測獸肉中萊克多巴胺

黃永生，葉夏聲，何玉榆，黃 婷，陳 彤*

(1.深圳市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測中心，廣東 深圳 518000；2.廣東省市場監(jiān)督管理局食用農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518000)

鹽酸萊克多巴胺(ractopamine，RAC)，別名雷托巴胺、舒喘靈、金萊多巴、權(quán)萊克、Paylean，化學(xué)名稱為4-[3-[2-羥基-2-(4-羥基苯基)-乙基] 氨基丁基] 苯酚(4-[3-[2-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-ethyl]aminobutyl]phenol)，是美國研制合成的一種β-腎上腺受體激動(dòng)劑類化合物，但被非法商家用作新一代的瘦肉精，被添加于飼料產(chǎn)品中，用于替代克倫特羅來提高動(dòng)物生產(chǎn)效率[1]。相比克倫特羅，RAC 具有毒性小、代謝快的特性，故各國政府對其在養(yǎng)殖業(yè)中適用范圍的規(guī)定各不相同。目前，在美國、日本、墨西哥、澳大利亞等國家，RAC 可作為瘦肉精被用在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，以此來提高畜禽的蛋白質(zhì)含量及瘦肉率。但消費(fèi)者大量食用含RAC 殘留的肉制品后，大概率會引發(fā)中毒癥狀，如惡心、嘔吐、頭暈、頭痛、肌肉震顫、心悸、心律失常、血壓上升等，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)绊懮诚到y(tǒng)[2-4]。故為了國民身體健康安全，我國政府已經(jīng)對該類藥物實(shí)施全面禁用，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在第235 號公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中將萊克多巴胺及其鹽類物質(zhì)列為檢測藥品，并于2011 年12 月5 日起在中國境內(nèi)禁止生產(chǎn)和銷售RAC；在第176 號等公告中明確了在動(dòng)物飼養(yǎng)過程中禁止使用鹽酸克倫特羅。

目前，對萊克多巴胺的檢測有多種方法，主要有氣質(zhì)聯(lián)用法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、毛細(xì)管電泳技術(shù)、液相色譜—質(zhì)譜法等[5-7]，但這些方法大多存在前處理過程繁瑣、復(fù)雜、費(fèi)時(shí)的缺點(diǎn)，快速檢測的方法則存在精準(zhǔn)度低、檢測對象單一等不足。故本研究基于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1025 公告-18-2008《動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》、GB/T21313-2017《動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/ 質(zhì)譜法》、GB/T22286-2008《動(dòng)物源性食品中多種β-受體激動(dòng)劑殘留量的測定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》等[8-10]，建立了一種樣品的快速凈化手段，縮短了前處理的時(shí)間，有效地提高了檢測工作的效率。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

安捷倫1290 液相色譜儀、AB Science 質(zhì)譜儀、氮吹儀、多管漩渦混合儀、天平、旋渦混合器、冷凍離心機(jī)、超純水儀、超聲波清洗機(jī)、混合陽性離子(mixed-mode cation exchanger，MCX 固相萃取柱(規(guī)格為3 cc、60 mg)、恒溫水浴搖床。

1.1.2 藥品與試劑

0.2 mol/L 乙酸銨(pH=5.2)；0.1 mol/L高氯酸溶液；5%氨化甲醇；甲醇(色譜純)、甲酸(色譜純)；乙酸(分析純)；氫氧化鈉(分析純)；β-葡萄糖醛苷酸酶/ 芳基硫酸酯酶(20 U/mL)；復(fù)溶液：甲醇/水/甲酸(v/v/v=10∶90∶0.09)。

1.2 樣品準(zhǔn)備

取適量新鮮牛肉組織，將其攪碎為肉質(zhì)均勻的狀態(tài)，于-20 ℃避光保存。

1.3 標(biāo)液配制

準(zhǔn)確稱取萊克多巴胺的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配成100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18 ℃冰箱中保存，有效期6 個(gè)月；再分別移取適量的萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇逐級稀釋成適當(dāng)濃度的萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.00 g(±0.01 g) 試樣，置于50 mL 離心管中，加入8.0 mL 0.2 moL/L 乙酸銨溶液(pH=5.2) 和40 μL β-葡萄糖醛苷酸酶/ 芳基硫酸酯酶(20 U/mL)，加蓋2 000 r/min 渦旋振蕩8 min，37 ℃恒溫?fù)u床避光酶解18 h。酶解后放置至室溫，在酶解液中加入300 μL 高氯酸(將pH 調(diào)至1.00)，渦旋30 s，10 000 r/min 低溫離心5 min，移上清液于另一離心管中。在殘?jiān)屑尤? mL 0.1 mol/L 高氯酸溶液，渦旋30 s，10 000 r/min 低溫離心5 min，合并上清液。上清液中加入570 μL 5 mol/L 的NaOH(將pH 調(diào)至4.00)，備用。

MCX 固相萃取柱分別依次用5 mL 甲醇、5 mL 水活化。取備用液全部過柱，再依次用5 mL 水、5 mL 甲醇淋洗小柱，抽干。用5 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集至15 mL 塑料離心管。洗脫液在50 ℃下氮?dú)獯蹈桑脧?fù)溶劑將濃縮液定容至1 mL，劇烈振蕩5 min，用1 mL 針筒移取過0.22 μm 濾膜，供液質(zhì)儀測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1025 號公告-18-2008《動(dòng)物源食品中磺胺類藥物殘留檢測液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》標(biāo)準(zhǔn)條件設(shè)置儀器參數(shù)，配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液(0.25 μg/kg、0.50 μg/kg、1.00 μg/kg、2.50 μg/kg、5.00 μg/kg)，待儀器基線穩(wěn)定后，對系列標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 93。

2.2 檢出限測定

使用空白牛肉樣品做基質(zhì)，設(shè)置一個(gè)濃度C (0.25 μg/kg) 的陽性樣，按照操作進(jìn)行前處理，之后上機(jī)測定，測得萊克多巴胺的信噪比為S/N=10.9，可計(jì)算檢出限(method detection limit，MDL)為0.068 8 μg/kg。計(jì)算公式如下：

檢出限(MDL)(μg/kg)=3C/(S/N)

2.3 方法精密度和回收率測定

以空白牛肉樣品為基質(zhì)，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)濃度為0.25 μg/kg、0.50 μg/kg、2.50 μg/kg。將加標(biāo)樣品和空白樣品按方法進(jìn)行前處理，上機(jī)測試，方法精密度和回收率結(jié)果分別見表1、表2 所示。根據(jù)表1 與表2中相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，該方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較低，且回收率表現(xiàn)較好，萊克多巴胺的回收率介于93.4%～100.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～3.7%。該方法的檢出限較低、重復(fù)性較好，也能保持較為優(yōu)異的回收率，可用于萊克多巴胺的準(zhǔn)確定性、定量檢測。

3 結(jié)論

本研究提出了一種高效檢測萊克多巴胺的方法，優(yōu)化了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)提取步驟，采用乙酸銨對酶解后的牛肉進(jìn)行提取，提取離心后過固相萃取柱進(jìn)行凈化，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測定。整個(gè)過程所進(jìn)行操作簡單，對前處理過程設(shè)備要求低，所需溶劑相對較少。同時(shí)，結(jié)果表明，該方法的檢出限低，回收率較好，且重復(fù)效果好，有效地消除了基質(zhì)效應(yīng)的干擾，提高了萊克多巴胺的方法檢測的準(zhǔn)確性及精密度，有效地節(jié)約了檢測時(shí)間和人力，提升了檢測的效果。通過多種食品樣品的實(shí)測實(shí)驗(yàn)證明，本方法適用于畜禽肌肉組織中萊克多巴胺的快速定性、定量檢測。