禽源性大腸桿菌對(duì)小白鼠致病性和治療用藥選擇研究

李永光，張棟棟，張曉菊，葛婷婷，王丹丹，寇新蕾，何 健，李莉莉

(1.甘肅省定西市臨洮農(nóng)業(yè)學(xué)校，甘肅 臨洮 730500；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，甘肅 臨洮 730500；3.臨洮縣洮陽(yáng)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站 甘肅 臨洮 730500))

1885 年，大腸桿菌首次被德國(guó)科學(xué)家Theodor Escherich 在健康人的糞便中發(fā)現(xiàn)和分離。該菌為中等大小的腸桿菌，大小為1～3 μm×0.5～0.7 μm，單個(gè)或成雙，無(wú)芽孢，大多數(shù)具有周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，革蘭氏染色陰性，需氧或兼性厭氧。大腸桿菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求不高，適應(yīng)性強(qiáng)，最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃，最適pH 為7.2～7.4。大腸桿菌在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)良好，菌落形態(tài)為光滑、濕潤(rùn)、半透明、2～3 mm 的灰白色菌落，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成紅色菌落，在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上形成黑色帶金屬光澤菌落[1]。

大腸桿菌廣泛存在于動(dòng)物的飼養(yǎng)舍、活動(dòng)場(chǎng)所、動(dòng)物體表等地方，以及飼料、飲水和動(dòng)物糞便中，如在1 g 動(dòng)物糞便中約含有106個(gè)大腸肝菌。大腸桿菌為條件性致病菌，當(dāng)人和動(dòng)物機(jī)體在應(yīng)激條件下或抵抗力減弱時(shí)，可導(dǎo)致胃腸道等多種器官出現(xiàn)病變，出現(xiàn)腸胃炎、腹痛、發(fā)熱、腹瀉等臨床表現(xiàn)。在畜牧業(yè)的飼養(yǎng)生產(chǎn)中，大腸桿菌對(duì)動(dòng)物(尤其是豬和雞)的健康危害較大，每年由大腸桿菌引發(fā)的動(dòng)物疾病(如禽大腸桿菌病、仔豬黃痢、仔豬白痢、斷奶仔豬腹瀉等)，給畜牧生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究通過(guò)將禽源性大腸桿菌經(jīng)腹腔接種小白鼠，3 d 后觀察小白鼠的臨床癥狀，隨后剖檢觀察組織器官的變化，旨在觀察禽源性大腸桿菌病的病理變化，為家禽大腸桿菌病的剖檢診斷做好準(zhǔn)備。與此同時(shí)，設(shè)計(jì)禽源性大腸桿菌藥敏試驗(yàn)，探究多種抗生素對(duì)禽源性大腸桿菌的敏感性，為臨床家禽大腸桿菌病治療藥物的選擇做好理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和禽源性大腸桿菌

試驗(yàn)用小白鼠購(gòu)買(mǎi)于蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，禽源性大腸桿菌菌種由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 藥物

試驗(yàn)所用的多西環(huán)素(DO30)、多粘菌素(PB300)、磺胺甲噁唑(SX25)、新霉素(N30)、羧芐西林(CB100)、萬(wàn)古霉素(YA30)均為從市場(chǎng)上正規(guī)商店購(gòu)買(mǎi)的藥品。

1.1.3 培養(yǎng)基

1.1.1.1 LB 液體培養(yǎng)基

用電子天平稱(chēng)取胰蛋白胨1 g、酵母提取物0.5 g、氯化鈉1 g，將它們放入200 mL 的錐形瓶中，再加蒸餾水至100 mL，用pH 計(jì)調(diào)節(jié)將液體的pH 調(diào)至7.2，隨后用高壓蒸汽滅菌器滅菌后備用。

1.1.1.2 LB 固體平板培養(yǎng)基

用電子天平稱(chēng)取瓊脂粉1.5 g，加入至100 mL LB 液體培養(yǎng)基中，高壓蒸汽滅菌器高壓滅菌，滅菌后置于超凈工作臺(tái)中，待溫度降至50～60 ℃時(shí)，倒置溶菌肉湯(lysogeny broth，LB)固體平板培養(yǎng)基，冷卻后置于4 ℃冰箱備用。

1.1.1.3 伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基

用電子天平稱(chēng)稱(chēng)伊紅美蘭瓊脂5 g，隨后放入200 mL 的錐形瓶中，加蒸餾水至100 mL，經(jīng)高壓蒸汽滅菌器高壓滅菌，滅菌后置于超凈工作臺(tái)中，待溫度降至50～60 ℃時(shí)，倒置伊紅美蘭瓊脂平板，冷卻后置于4 ℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌的培養(yǎng)

1.2.1.1 大腸桿菌接種

在超凈工作臺(tái)中將禽源性大腸桿菌菌種接種于LB 培養(yǎng)基。

1.2.1.2 大腸桿菌培養(yǎng)

將接種了禽源性大腸桿菌菌種的LB 培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h。檢測(cè)菌懸液濃度為7.2×108CFU/mL。

1.2.2 小白鼠的接種與剖解

取10 只小白鼠，每只灌服過(guò)夜培養(yǎng)的禽源性大腸桿菌菌液0.5 mL，接種后置于動(dòng)物房單獨(dú)飼養(yǎng)，并觀察它們的死亡情況和臨床變化。3 d 后，對(duì)未死亡小白鼠進(jìn)行頸部脫臼致死，經(jīng)75%酒精浸泡消毒后，然后固定于小動(dòng)物剖檢臺(tái)上，在酒精燈火焰10 cm 范圍內(nèi)剖檢，眼科鑷子輕輕提起小白鼠腹壁，眼科剪剪開(kāi)腹壁，觀察腹壁下是否出血。然后打開(kāi)腹腔，逐個(gè)觀察腹腔內(nèi)肝臟、胃、腸、脾臟等器官的病理變化。打開(kāi)胸腔，觀察胸腔內(nèi)肺臟和心臟的病理變化。

1.2.3 大腸桿菌鑒定

眼科剪刀經(jīng)灼燒消毒，消毒小白鼠肝臟病變部位表面，剪開(kāi)病變部位，酒精燈火焰灼燒接種環(huán)，蘸取病變部位劃線接種于伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)，鑒定病原是否為大腸桿菌。

1.2.4 藥敏試驗(yàn)

提前30 min 取出LB 固體平板培養(yǎng)基置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，吸取1 mL 禽源性大腸桿菌菌液，用涂布棒將菌液均勻涂布于LB 固體平板培養(yǎng)基上，將多西環(huán)素(DO30)、多粘菌素(PB300)、磺胺甲噁唑(SX25)、新霉素(N30)、羧芐西林(CB100)、萬(wàn)古霉素(YA30)等藥敏片均勻貼置于平板內(nèi)，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，觀察各種抗菌藥對(duì)大腸桿菌的抑殺作用，為大腸桿菌病的治療選藥做參考。

2 研究結(jié)果

2.1 小白鼠感染禽源性大腸桿菌后病變

2.1.1 外觀變化

在10 只接種禽源性大腸桿菌菌液的實(shí)驗(yàn)小白鼠中，死亡6 只，死亡率達(dá)60%；剩余4 只精神萎靡，被毛粗亂，食欲下降，個(gè)別眼瞼粘連。

2.1.2 病理剖檢變化

剖檢發(fā)現(xiàn)，大部分小白鼠的肝臟腫大，肝臟表面有點(diǎn)狀或斑塊狀出血；個(gè)別小白鼠胃部膨大，充滿內(nèi)容物；十二指腸水腫，腸壁變薄，腸內(nèi)充滿淡黃色的內(nèi)容物。脾臟充血腫大，邊緣呈暗紫色；腎臟略腫大，顏色變深；心臟、肺臟等其他臟器未見(jiàn)明顯異常。小白鼠病變主要在肝臟和小腸，臨床上動(dòng)物感染大腸桿菌病后主要表現(xiàn)為腹瀉等腸道炎癥(圖1)。

2.2 大腸桿菌感染驗(yàn)證結(jié)果

用接種環(huán)挑取感染小白鼠病變部位，用劃線方式接種于伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h 后，生長(zhǎng)出黑色帶金屬光澤的圓形菌落，證明小白鼠病變部位的病原菌為大腸桿菌，根據(jù)科赫法則可以推斷小白鼠的病變是由大腸桿菌導(dǎo)致的(圖2)。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)多西環(huán)素(DO30)、多粘菌素(PB300)、磺胺甲噁唑(SX25)、新霉素(N30)、羧芐西林(CB100)、萬(wàn)古霉素(YA30)等藥敏片對(duì)涂布于LB 固體平板培養(yǎng)基上的禽源性大腸桿菌的抑菌圈直徑大小，判斷出禽源性大腸桿菌對(duì)多種抗菌藥的敏感程度，為臨床上家禽大腸桿菌病選取高效的治療藥物(圖3、表1)。

新霉素(N30)對(duì)禽源性大腸桿菌的抑菌圈直徑為21 mm，大于20 mm；多粘菌素對(duì)禽源性大腸桿菌的抑菌圈直徑為15 mm，大于9 mm，按照藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)，判定出禽源性大腸桿菌對(duì)此兩種抗菌藥物超級(jí)敏感，臨床上可以選用新霉素和多粘菌素治療禽源性大腸桿菌引起的動(dòng)物疾病，理論上會(huì)有較好的治療效果。其他4 種抗菌藥的抑菌圈直徑為均為0，證明這4種抗菌藥對(duì)禽源性大腸桿菌無(wú)任何抑制和殺滅效果，臨床上不能用來(lái)治療禽源性大腸桿菌引起的疾病。

3 結(jié)論與討論

對(duì)大腸桿菌的不同分離株采用不同接種途徑，被感染小白鼠會(huì)表現(xiàn)出不同的臨床癥狀和死亡率。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腹腔注射接種途徑，給10只小白鼠接種甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存的禽源性大腸桿菌，結(jié)果死亡率高達(dá)60%，存活小白鼠表現(xiàn)為精神萎靡，出現(xiàn)較嚴(yán)重的癥狀；李基棕等[2]研究發(fā)現(xiàn)，豬場(chǎng)環(huán)境中的大腸桿菌對(duì)小白鼠的致死率高達(dá)51.3%，其中污水和空氣中的大腸桿菌菌株對(duì)小白鼠的致死率最高達(dá)66.7%；陳亢川等[3]對(duì)從人體和動(dòng)物體中分離到的7 株O157 大腸桿菌在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行大量培養(yǎng)，隨后采用腹腔接種的方式感染小白鼠，結(jié)果接種的小白鼠均出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀；海巖等[4]用從患有乳房炎的奶牛中分離到的大腸桿菌經(jīng)腹腔接種小白鼠，致死率為81.8%；趙素微等[5]用從乳腺炎患病牛中分離的大腸桿菌菌株經(jīng)腹腔接種小白鼠，致病率高達(dá)90%；但是在文獻(xiàn)報(bào)道中，Isogai 等將腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagicEscherichia coli，EHEC) O157:H7-EDL 931 株和7 號(hào)株經(jīng)口腔灌服IQI 小鼠，剖檢發(fā)現(xiàn)胃腸道無(wú)組織學(xué)病變[6]。

在藥敏試驗(yàn)中，對(duì)大腸桿菌具有較好抑殺作用的藥物包括新霉素和多粘菌素。新霉素對(duì)大腸埃希菌以及克雷伯菌屬、變形桿菌屬、腸桿菌屬、沙門(mén)菌屬、志賀菌屬、布魯菌屬等革蘭氏陰性菌有較強(qiáng)的殺傷效果，殺菌原理是其能夠結(jié)合細(xì)菌核糖體30 S 亞單位，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。但是，革蘭氏陰性菌與新霉素接觸后極易產(chǎn)生耐藥性，從而使后者失去殺菌作用，臨床上可采用交替用藥和聯(lián)合用藥的方式使用新霉素與慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、妥布霉素等氨基糖苷類(lèi)抗生素，以減少或延緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。多黏菌素為多肽類(lèi)抗生素，由多黏類(lèi)芽孢桿菌產(chǎn)生，臨床上對(duì)大腸桿菌、肺炎桿菌、綠膿桿菌等革蘭氏陰性菌所致感染有較好治療效果。

本試驗(yàn)初步建立了禽源性大腸桿菌感染小白鼠模型，通過(guò)藥敏試驗(yàn)找到了大腸桿菌敏感藥物，為臨床大腸桿菌性疾病的診斷、治療和防制提供理論支持。