先兆流產孕婦外周血淋巴細胞培養與染色體核型分析結果的研究

蔡 敏，彭小媚，程 銘

（賀州市人民醫院檢驗科，廣西 賀州 542800）

先兆流產是指女性在妊娠28 周前先出現少量陰道流血，后出現陣發性下腹痛或腰痛，盆腔檢查提示宮口未開、胎膜完整，無妊娠物排出，子宮大小與孕周相符的一種表現[1-2]。先兆流產孕婦若癥狀持續加重，可發展為難免流產。研究報道，染色體異常是引起先兆流產的主要原因，包括染色體數量異常和結構異常，在早期自然流產中有50% ～60% 的妊娠物中有染色體異常，夫婦中有1 人染色體異常即可傳至后代，導致流產或反復流產[3-4]。因此，現階段對先兆流產孕婦進行染色體核型分析逐漸引起研究者的關注。染色體核型分析是以分裂中期染色體為研究對象，根據染色體的長度、著絲點位置、長短臂比例和隨體的有無等特征，借助顯帶技術對染色體進行分析、比較、排序與編號，根據染色體結構與數目的變異情況進行診斷，可為細胞遺傳分類、物種間親緣關系及染色體數目、結構變異的研究提供理論依據[5-6]。外周血淋巴細胞培養是染色體檢測的常用方法。據報道，外周血淋巴細胞培養在不孕不育和生殖科的臨床診療中已取得諸多成效，但在先兆流產診療中應用的報道還相對較少[7-8]。故本研究對先兆流產孕婦的外周血淋巴細胞培養與染色體核型分析結果進行探討，旨在為臨床優生優育、保胎護胎提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015 年1 月至2021 年1 月在我院生殖中心就診的先兆流產孕婦514 例及同期進行常規產檢的健康孕婦514 例作為研究對象。將其中514 例先兆流產孕婦作為試驗組，將其中514 例健康孕婦作為對照組。病例的納入標準：試驗組孕婦的病情符合先兆流產的診斷標準[9]，需要予以保胎等相關處理；對研究內容知情，并簽署了知情同意書。病例的排除標準：存在心、肝、腎等器官功能不全；合并有惡性腫瘤；既往有流產史。兩組孕婦的一般資料相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表1。本研究已通過我院醫學倫理委員會的批準。

表1 兩組孕婦一般資料的比較

1.2 方法

所有入組孕婦均行外周血淋巴細胞培養，并于G顯帶后行外周染色體核型分析，具體的檢測流程是：在無菌條件下采集孕婦的肘正中靜脈血3mL，將血液標本置于外周血淋巴細胞培養基中，并在37℃的環境下培養66 ～68h。之后在培養基中加入秋水仙素，繼續培養72h 后行離心處理（轉速為1500r/min，離心時間為10min）。收集培養物，用0.075% 的氯化鉀（KCL）低滲處理35min，加入固定液固定30min 后進行制片和染色顯帶。于G 顯帶后行外周染色體核型分析，每個病例于油鏡下計數30 個中期分裂相，分析5 ～8 個核型，異常標本加倍至50 個核型，根據細胞遺傳學國際命名體制[10]進行外周血染色體核型分析和命名。

1.3 觀察指標

比較兩組孕婦染色體核型異常的發生率。觀察試驗組中染色體結構異常孕婦與染色體數目異常孕婦的具體情況。觀察試驗組中多態性異常核型孕婦的具體情況。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件對本研究中先兆流產孕婦的臨床資料進行整理與分析，滿足正態分布且方差齊的計量資料采用±s表示，用t檢驗；計數資料用% 表示，用χ2 檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組孕婦染色體核型異常發生率的比較

對兩組孕婦進行外周血淋巴細胞培養與染色體核型分析的結果顯示，試驗組中共檢出105 例染色體核型異常者，其中染色體結構異常者有99 例，染色體數目異常者有6 例；對照組中共檢出5 例染色體核型異常者，均為多態性核型。試驗組孕婦染色體核型異常的發生率為20.43%，顯著高于對照組孕婦的0.97%（P＜0.05）。詳見表2。

表2 兩組孕婦染色體核型異常發生率的比較[例（%）]

2.2 試驗組中99 例染色體結構異常孕婦的具體情況分析

在試驗組99 例染色體結構異常孕婦中，多態性異常核型孕婦最多，占組內染色體核型異常孕婦總數的65.71%，相互易位核型、羅伯遜易位核型、倒位核型孕婦分別占組內染色體核型異常孕婦總數的17.14%、9.52%、1.90%。詳見表3。

表3 試驗組中99 例染色體結構異常孕婦的具體情況分析（%）

2.3 試驗組中6 例染色體數目異常孕婦的具體情況分析

在試驗組6 例染色體數目異常孕婦中，三體型異常核型、單體型異常核型、嵌合體型異常核型孕婦分別有3 例、2 例、1 例，分別占組內染色體核型異常孕婦總數的2.86%、1.90%、0.95。詳見表4。

表4 試驗組中6 例染色體數目異常孕婦的具體情況分析（%）

2.4 試驗組中69 例多態性異常核型孕婦的具體情況分析

在試驗組69 例多態性異常核型孕婦中，D/G 組染色體隨體區變異孕婦共有32 例（其中13、14、15、21、22 號染色體變異孕婦分別有12 例、3 例、9例、4 例、4 例），占組內染色體核型異常孕婦總數的30.48%；1、5、9、16 號染色體變異孕婦共有24 例（其中次縊痕增加包括1qh+、5qh+、9qh+、16qh+ 孕婦分別有5 例、5 例、8 例、6 例），占組內染色體核型異常孕婦總數的22.86%；Y 染色體異染色質變異孕婦共有13 例（其中Yqh+、Yqh-孕婦分別有7 例、6 例），占組內染色體核型異常孕婦總數的12.38%。詳見表5。

表5 試驗組中69 例多態性異常核型孕婦的具體情況分析（%）

3 討論

導致先兆流產發生的原因較多，目前臨床上多認為胚胎、母體、父親及環境因素與先兆流產的發生有關，保胎治療是其常規的治療方案[11]。先兆流產孕婦若陰道流血增多或腹痛加劇，導致不可避免的流產時，多需要及時終止妊娠。早期進行染色體檢測對促進優生優育有重要的意義。本研究中進行外周血淋巴細胞培養與染色體核型分析的結果顯示，試驗組孕婦染色體核型異常的發生率為20.43%，顯著高于對照組孕婦的0.97%（P＜0.05）。故推測先兆流產的發生與母體染色體核型異常有關，尤其與多態性核型關系密切。染色體多態性是結構性異染色質中重復的DNA 序列，具有良好的密集型和固縮性，在穩定姐妹染色單體的分離與結合、同源染色體的配對中有一定作用，其異常表現為同源染色體大小、形態或著色強度的差異，且有明顯的生物遺傳效應。研究指出，先兆流產孕婦的染色體多態性常發生于9 號染色體，證實了多態性異常核型與先兆流產結局有關[12]。分析原因可能與染色體的生長、分裂過程有關，母體中多態性染色體會增加配子在減數分裂過程中的不穩定性，直接影響受精及胎兒發育的過程，提升了先兆流產的發生風險。相互易位與羅伯遜易位核型對先兆流產亦有重要影響。劉芳[13]、邱峰龍等[14]研究報道，約有4% 的先兆流產孕婦經觀察發現有染色體核型改變，包括平衡易位、羅伯遜易位、染色體嵌合與倒位。其中染色體相互易位是指兩種不同染色體的片段發生重新排列，雖然在個體上進行了重新排列，但基因數量未發生明顯變化，故而胚胎發育上相對正常。然而相互易位的染色體在減數分裂過程中經分離、配對與互換后可產生18 種合子，除去其中1 種正常核型、1 種平衡易位外，余下的染色體均為部分三體或單體的不平衡易位，導致受精卵結合后由于遺傳物質的不平衡難以完成胚胎發育的生命活動，故而發生流產。本研究中入組的514 例試驗組孕婦染色體相互易位的發生率為3.50%，顯著高于正常孕婦。羅伯遜易位也是臨床上多見的染色體重排，是發生于近端著絲粒染色體的一種易位形式，指兩個近端著絲粒染色體在著絲粒部位發生斷裂后，二者的長臂于著絲粒處接合并形成一條由長臂構成的衍生染色體，其斷臂在構成小染色體后于第二次分裂時丟失[15]。小染色體的全部基因均表達在前者的長臂染色體中，因此羅伯遜易位中只有45 條染色體，其表型多為正常，但在形成配子時可發生異常，引起先兆流產或胎兒死亡。本研究中入組的514 例試驗組孕婦染色體羅伯遜易位的發生率為1.95%，顯著高于正常孕婦。同源性羅伯遜易位孕婦產生的胚胎染色體多為單體或三體形式，其常于妊娠早期發生流產；在非同源性羅伯遜易位孕婦的胎兒中，僅有1/3 胎兒可發育為正常新生兒，余下2/3 胎兒多為畸形兒或發生流產。

本研究的結果顯示，在試驗組99 例染色體結構異常孕婦中，多態性異常核型孕婦最多，占65.71%，而相互易位核型、羅伯遜易位核型、倒位核型孕婦分別占17.14%、9.52%、1.90%。染色體倒位（inversion）指同一條染色體發生兩處斷裂，其中間部分倒轉180°后重新連接，若斷裂處發生于染色體其中一條臂上則稱為臂內倒位，若發生于長短臂之間的絲粒區則稱為臂間倒位[16]。臂內倒位時兩條染色體的長度不發生變化，臂間倒位時兩條染色體的長臂與短臂均出現遞減。染色體倒位多見于9 號染色體，故而inv(9)具有基因多態性，但與遺傳物質改變無關，因此不會產生遺傳效應。既往的報道指出，inv(9) 在不孕不育、流產和出生畸形人群中的水平顯著升高，而染色體臂間倒位片段的長度與不良妊娠結局關系密切，臂間倒位的片段越長，形成交叉環的幾率越大，其產生不平衡配子的相對概率越小，故而活產率也更高[17]。本研究的結果顯示，在試驗組6 例染色體數目異常孕婦中，三體型異常核型、單體型異常核型、嵌合體型異常核型孕婦分別有3 例、2 例、1 例，分別占2.86%、1.90%、0.95%。表明先兆流產中常染色體三體型與性染色體單體型均為先兆流產染色體數目異常核型的主要類型。既往的研究發現，染色體三體和單體型異常孕婦具有較高的自然流產率[18]。這與本研究中的部分觀點相似。分析其原因在于，父親或母親在配子形成時受精卵于分裂過程中出現了染色體的不分離現象，導致該染色體異常增多1 條或異常減少1 條，即出現三體型或單體型染色體。本研究的結果顯示，在試驗組69 例多態性異常核型孕婦中，D/G 組染色體隨體區變異孕婦共有32 例，1、5、9、16 號染色體變異孕婦共有24 例，Y 染色體異染色質變異孕婦共有13 例。染色體多態性又稱為異態性，指正常人群行染色體檢查中所發現的微小變異。既往有研究認為，在流產人群中染色體多態性具有較高的發病率[19]。本研究中入組的514 例試驗組孕婦中有69 例孕婦出現了染色體多態性，占組內染色體核型異常孕婦總數的71.13%。故考慮染色體多態性與先兆流產關系密切。染色體多態性具有明顯的生物遺傳效應，常僅涉及一對同源染色體中的一個。例如，染色體D/G 組的隨體增加、減少或重復、短臂的長短變異，1、9、16 號等染色體著絲粒區熒光強度變異、次縊痕區的加長或縮短等，以及Y 染色體長臂異染色質部分長度的變異。染色體隨體變異與孕婦的不良孕產史關系密切，故而在本研究中參與先兆流產的發生。分析其原因可能與染色體隨體變異的生理機制有關。染色體在分裂的過程中阻礙了紡錘絲與著絲粒的緊密關系，使染色體發生分離，而Y 染色體多態性與長臂遠端異染色質部分（q12）的長度有關。具體而言，Y 染色體多態性與異染色部分DNA 序列的缺失、重復或螺旋化有關。有學者認為該多態性差異主要與孕婦及其配偶所在的種族與地區差異有關[20]。而Y 染色體長臂差異引起流產的臨床效應近些年也逐漸引起人們的關注，分析其機制可能是DNA 序列因高度重復導致基因功能喪失，影響了精子的正常發育和基因表達，導致受精卵在母體妊娠期間發育不足，進而導致先兆流產的發生。因此，在備孕期間不單應關注母體的染色體水平，其配偶的Y 染色體基因檢測也應引起足夠的重視。

綜上所述，先兆流產孕婦染色體核型異常的發生率較高。臨床醫師應重視染色體異常的遺傳學因素對先兆流產造成的影響，及時對孕早期孕婦行外周血淋巴細胞培養與染色體核型分析，分辨染色體的結構、數目和多態性變化，早期識別并干預先兆流產。