河南省部分地區(qū)飼料和雞蛋中恩諾沙星檢測分析

芮亞培，陳 穎，趙 聘，黃 立，劉 濤，馬全朝，丁志剛，楊新亞，張文翔，王 偉，李森茂，盛 偉，李 華，邱 剛*

（1.信陽農(nóng)林學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，河南信陽 464001；2.固始縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南固始 465250；3.信陽市平橋區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南信陽 464000）

1 獸藥殘留概況

1.1 獸藥殘留現(xiàn)狀 2017年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的獸藥殘留監(jiān)控計(jì)劃結(jié)果顯示，畜禽產(chǎn)品合格率為99.72%（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告，2017）。2019年山東省雞蛋中檢出批數(shù)最多的藥物是氟苯尼考，檢出率較高的有恩諾沙星和環(huán)丙沙星（楊修鎮(zhèn)等，2020）。2016年云南省部分地區(qū)的67份雞蛋檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，喹諾酮類藥物的檢出率為4.48%（楊萍等，2017）。2017年杭州市88份動(dòng)物性食品喹諾酮類藥物總檢出率為19.4%，在陽性樣品中恩諾沙星的檢出比例最高，為68%（劉少穎等，2018）。2018年京冀兩地動(dòng)物源性食品樣品檢測中71批雞肉恩諾沙星不合格率為1.41%，62批雞蛋中恩諾沙星不合格率為4.84%（許健和彭婷婷，2020）。以上研究表明，喹諾酮類藥物殘留是食品檢測不合格的重要原因，且以恩諾沙星所占比例較高。

1.2 高效液相色譜儀適用性

1.2.1 高效液相色譜儀的定量方法 外標(biāo)法操作相對簡便，適用于樣本量較大的檢測，且外標(biāo)法與內(nèi)標(biāo)法的測定結(jié)果無顯著差異（許健和彭婷婷，2020）。

1.2.2 高效液相色譜儀的優(yōu)勢 氣相色譜對分析化合物要求較高，在應(yīng)用范圍存在一定限制（周春紅等，2011）。高效液相色譜儀應(yīng)用范圍廣，大多數(shù)有機(jī)物可使用高效液相色譜分析，且對大分子，強(qiáng)極性，高沸點(diǎn)，熱穩(wěn)定性差的化合物仍有較好的分析效果，較好的解決了氣相色譜應(yīng)用范圍小的問題。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用在色譜分離基礎(chǔ)上利用質(zhì)荷比進(jìn)行二次分離，用保留時(shí)間和離子豐度比雙重定性較高效液相色譜儀更加準(zhǔn)確，但液質(zhì)聯(lián)用儀的價(jià)格遠(yuǎn)高于高效液相色譜儀，在我國獸藥殘留檢測一線較難普及（李國琛等，2020）。

1.3 獸藥殘留檢測趨勢 在新基質(zhì)中檢測獸藥殘留。大多數(shù)抗生素的活性成分在給藥后以原型或新陳代謝的形式排出體外，通過檢測糞便和尿液可以了解抗生素在牲畜中的使用情況（Patyra等，2020）。也可通過對馬的毛發(fā)進(jìn)行檢測和定量去了解使用藥物種類和用藥時(shí)間（Madry等，2016）。該方法為馬的用藥回顧性追蹤提供了非常有價(jià)值的工具。

同時(shí)，測定食品中多類別、多組分的獸藥殘留。液質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合QuEChERS-MAS分散式固相萃取凈化方法可同時(shí)測定雞蛋中38種藥物（王嬌等，2020）。QuEChERS EMR-Lipid技術(shù)結(jié)合液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用可以檢測豬肉中55種獸藥殘留（黃澤瑋等，2019）。

1.4 研究意義 我國規(guī)定蛋雞產(chǎn)蛋期禁用恩諾沙星，但多數(shù)養(yǎng)殖場存在養(yǎng)殖密度過大，環(huán)境衛(wèi)生惡劣等問題，需要使用大量的廣譜抗生素。恩諾沙星屬于喹諾酮類抗生素，長期過量食用恩諾沙星超標(biāo)的食品會(huì)損害肝臟，影響神經(jīng)系統(tǒng)和軟骨的發(fā)育。長期濫用抗生素會(huì)導(dǎo)致菌群耐藥性逐漸增強(qiáng)，使得治療相關(guān)感染失敗和感染嚴(yán)重的頻率提高。長時(shí)間或大劑量的喹諾酮類藥物會(huì)致癌、致畸、致突變。研究表明，喹諾酮類抗生素內(nèi)服后會(huì)迅速吸收，在體內(nèi)廣泛分布，后經(jīng)肝臟代謝特異性蓄積在卵黃中，導(dǎo)致蛋黃殘留的時(shí)間延遲（陳佳靜等，2020）。恩諾沙星分子及其代謝物在雞蛋煮沸、微波和煎蛋的過程中是穩(wěn)定的（Canton等，2019）。恩諾沙星在雞蛋中易蓄積且代謝緩慢，停藥25 d后儀器才未檢測出恩諾沙星（侯軒等，2020）。恩諾沙星是養(yǎng)殖過程中的常用藥物，且在雞蛋中易蓄積，代謝緩慢，烹飪過程中穩(wěn)定不易被破壞，對人體危害較大。因此，雞蛋中恩諾沙星的獸藥殘留檢測意義重大。

2 材料與方法

2.1 試劑 85%磷酸；三乙胺；氫氧化鈉；磷酸二氫鉀；正乙烷均為分析純（鄭州派尼化學(xué)試劑廠）；甲醇（美國Fisher）；乙腈（鄭州派尼化學(xué)試劑廠）為色譜純；恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品（壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）；超純水。

2.2 儀器 Waters e2695（配備2998 PDA Detector檢 測 器）；色 譜 柱 WAT054275（C18 250mm 5μm）；色譜柱 WAT045905（C18 150mm 5μm）；ME204E電子天平（梅特勒-托利多）；PH測定儀（上海精科）；100μL移液槍（DragonLab）；1 mL移液槍（DragonLab）；真空泵（上海亞榮生化儀器）；JJ-2BS勻漿機(jī)；QL-902渦旋儀（海門其林貝爾）；LKTC-L水浴加熱鍋；L400離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取0.12 g氫氧化鈉于燒杯中，用100 mL超純水溶解，獲得0.03 mol/L氫氧化鈉溶液。稱取10 mg恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL棕色容量瓶中，用0.03 mol/L氫氧化鈉溶液定容至刻度線，獲得1000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。從1000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中量取100μl置于10 mL棕色容量瓶中，用0.03 mol/L氫氧化鈉溶液定容至刻度線，獲得10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。重復(fù)上述操作可獲得0.1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

從10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中量取500μL置于10 mL棕色容量瓶中，使用流動(dòng)相磷酸三乙胺-乙腈（82：18）稀釋定容，獲得 500μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液。從10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中量取100μL置于10 mL棕色容量瓶中流動(dòng)相定容，獲得100μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液。從0.1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中量取500μL置于10 mL棕色容量瓶中流動(dòng)相定容，獲得5μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液。

通過上述的操作獲得5、100、500μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液。將標(biāo)準(zhǔn)工作液裝入樣品小瓶送入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測。標(biāo)準(zhǔn)曲線以恩諾沙星的濃度為橫坐標(biāo)，色譜圖的峰面積為縱坐標(biāo)繪制。

2.3.2 儀器參數(shù) 本次試驗(yàn)的儀器參數(shù)參考農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告中動(dòng)物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測高效液相色譜法。色譜柱WAT045905（C18 150 mm 5μm）與 公 告 中 色 譜 柱（C18 250 mm 5μm）有所不同，流動(dòng)相A：0.05 mol/L磷酸三乙胺溶液（85%磷酸量取1.7 mL用超純水稀釋至500 mL，加入三乙胺調(diào)定pH至2.4）流動(dòng)相C：乙腈，流動(dòng)相A（82%）與流動(dòng)相（18%）的比例進(jìn)行等度洗脫，流速：0.8 mL/min，每個(gè)樣品運(yùn)行5 min，進(jìn)樣量：20μL，柱溫：25℃，檢測波長：280 nm。

2.3.3 樣品前處理 本次樣品前處理參考高效液相色譜法快速測定飼料和雞蛋中5種氟喹諾酮類藥物殘留。稱取10 g氫氧化鈉置于燒杯中用50 mL超純水溶解，獲得5 mol/L氫氧化鈉溶液。稱取磷酸二氫鉀3.4 g置于燒杯中用250 mL超純水溶解，再加入5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)定pH至7.0，獲得0.1 mol/L磷酸緩沖液。

將飼料（加入一定比例蒸餾水）或雞蛋樣品加入到勻漿機(jī)中勻漿，稱取勻漿后的樣品2 g置于15 mL離心管中，加入1.25 mL乙腈后渦旋1 min，向離心管中加入0.1 mol/L磷酸緩沖液至13 mL刻度線，渦旋1 min。將離心管放入55℃水浴加熱鍋中加熱20 min后渦旋1 min，冷卻至室溫后加入2 mL正乙烷，渦旋1 min，離心管放入離心機(jī)中以4000 r/min離心15 min，棄去上層的正乙烷，取下層清液，通過0.22μm的一次性針式過濾器后裝入樣品小瓶。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 本次試驗(yàn)使用濃度為5、100、500μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液送入高效液相色譜儀中進(jìn)行檢測，獲得3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜圖，以恩諾沙星的濃度為橫坐標(biāo)，色譜圖的峰面積為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=1.51e+02X+2.22e+03，R2=0.999650。相關(guān)系數(shù)（R2）是試驗(yàn)數(shù)據(jù)和擬合函數(shù)之間吻合程度的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)系數(shù)的值越接近1代表試驗(yàn)數(shù)據(jù)和擬合函數(shù)的吻合程度越高。R2=0.999650說明本次試驗(yàn)數(shù)據(jù)與擬合函數(shù)間吻合度高，誤差較小。

3.2 實(shí)際檢測 本次試驗(yàn)檢測的飼料和雞蛋分別從飼料店、兩個(gè)超市和農(nóng)貿(mào)市場購買。利用建立的方法對3批次飼料和150批次雞蛋進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果合格率為100%。表明150批次飼料和雞蛋樣品質(zhì)量安全，不含恩諾沙星。高效液相色譜儀通過保留時(shí)間定性，由圖1標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜圖可知恩諾沙星的保留時(shí)間為2.874 min。在樣品色譜圖2.874 min未見色譜峰則認(rèn)為該樣品中不含恩諾沙星。

圖1 恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線和色譜圖

圖2 樣品檢測圖

4 討論

4.1 色譜條件優(yōu)化 本試驗(yàn)將WAT054275（C18，250 mm 5μm） 和 WAT045905（C18，150 mm 5μm）兩種不同長度的色譜柱進(jìn)行了對比。由圖3可知，250 mm色譜柱的保留時(shí)間為7.842 min，150 mm色譜柱的保留時(shí)間為2.874 min。色譜柱的柱效是以每米塔板數(shù)來計(jì)量的，色譜柱的長度與柱效和分離度成正比，但色譜柱長度的增加會(huì)導(dǎo)致分析時(shí)間的延長和成本的增加（許建軍等，2019）。本試驗(yàn)將標(biāo)準(zhǔn)工作液送入高效液相色譜儀并換上150 mm的色譜柱進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)色譜峰峰形良好，分離效果滿足試驗(yàn)需要，且分析時(shí)間縮短。

圖3 250nm和150nm色譜柱色譜圖的對比

4.2 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化 本次試驗(yàn)利用水溶性有機(jī)溶劑乙腈作為去蛋白試劑，使蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的氫鍵變化而出現(xiàn)蛋白質(zhì)沉淀（晉齊中等，2014）。在加入乙腈后再水浴加熱20 min幫助蛋白質(zhì)快速沉淀，可較完全除去飼料和雞蛋中的蛋白質(zhì)，避免對儀器的污染。根據(jù)相似相溶原理，飼料和雞蛋中的脂類溶解于正己烷，且正己烷的密度較小處于液體上層較易除去。目標(biāo)物恩諾沙星溶于磷酸緩沖液中，使用渦旋儀充分混勻溶解。被渦旋振蕩的提取液充分乳化，有利于在低速離心時(shí)形成結(jié)構(gòu)較緊密的絮狀層，使下層溶液清澈透明（楊嘉偉等，2016）。

4.3 樣品檢測數(shù)據(jù)的意義 2019年國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督抽檢中恩諾沙星和環(huán)丙沙星不合格率為1.3%，同年的農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全專項(xiàng)整治禽蛋產(chǎn)品的監(jiān)督抽查中恩諾沙星的不合格率為1%（彭文繡等，2020）。喹諾酮類藥物因抗菌譜廣和價(jià)格低廉等原因廣受畜禽養(yǎng)殖業(yè)的青睞。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194號(hào)2020年將停止生產(chǎn)、進(jìn)口、經(jīng)營、使用部分藥物飼料添加劑，退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種。目前多數(shù)養(yǎng)殖場存在雞群密度高、衛(wèi)生環(huán)境差等問題，且抗生素替代物的研究有限，與抗生素的效果相比還存在較大差距。本次樣品檢測數(shù)據(jù)幫助我們了解第194號(hào)公告發(fā)布后市場上雞蛋中恩諾沙星的獸藥殘留情況。

4.4 對策與建議

4.4.1 加強(qiáng)檢測，嚴(yán)厲打擊 對地區(qū)內(nèi)的養(yǎng)殖場進(jìn)行全面排查，并做好相應(yīng)記錄，建立“黑名單”，對檢測不合格的養(yǎng)殖場依法進(jìn)行嚴(yán)厲處罰。中國獸藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)仍存在種類不全面、限量值有待研究等問題，應(yīng)加快制定科學(xué)全面且符合國情的中國標(biāo)準(zhǔn)，推動(dòng)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定工作（張凱華等，2016）。

4.4.2 推廣使用非抗生素類飼料添加劑 微生態(tài)制劑在腸道中可分泌有機(jī)酸，抑制病原菌，調(diào)節(jié)腸道免疫功能，產(chǎn)生的代謝物和酶可形成化學(xué)屏障（周芷錦和穆琳，2020）。中藥抗菌成分眾多，可通過改變細(xì)胞膜通透性、影響蛋白質(zhì)和核酸的合成等方式產(chǎn)生抗菌作用（樸喜航和艾紅佳，2017）。噬菌體因其特異性強(qiáng)、無明顯副作用成為抗生素替代物中的一種。

5 結(jié)論

本文在國標(biāo)動(dòng)物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測高效液相色譜法和其他參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，建立了快速檢測雞蛋中恩諾沙星的方法，并對三地飼料和雞蛋進(jìn)行檢測。該方法樣品前處理較方便、快捷，無需使用固相萃取儀，且使用150 mm短色譜柱分析時(shí)間較短。飼料和雞蛋樣品的檢測為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號(hào)公告實(shí)行后市場上飼料中和雞蛋恩諾沙星的獸藥殘留情況提供參考。