牛羊肉中3種抗結核藥物的多殘留檢測方法的建立

魏佩玲，胡 波，張蓉銀，陸向梅，宮 平

（新疆畜牧科學院畜牧業質量標準研究所，新疆烏魯木齊 830000）

結核病菌除感染人外，還感染牛羊等哺乳動物。人結核有10%以上是由牛、羊結核分枝桿菌引起的，牛羊在新疆的結核發病率超過2%，且長期未受到關注（郭志文和武帥，2021；郭保民和劉紅葵，2012；楊醉宇等，2009；努爾扎提，2006）。為保障食品安全，避免牛、羊肉體內藥物殘留，需加強對牛、羊肉食品的安全監控，建立相應的殘留檢測方法（李國華，2017；陳古麗，2014）。因此，本項目針對這一情況，建立牛、羊肉中抗結核類藥物的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。

目前，針對牛羊肉的前處理方法主要有快速溶劑萃取、固相萃取、液-液萃取、基質固相分散技術等（吳會仙，2021；張曉燕，2021；喬麗娟，2020）。本實驗室選用固相萃取方法，此技術具有高效性和準確性高等優點（雷攀明，2021）。近年來，由于QuEChERS具有操作簡單、快速、準確度高的特點，被廣泛應用到農獸藥殘留檢測中（呂佳樂等，2020）。因此，本項目在建立檢測方法的過程中，在前處理部分（凈化條件的選擇）采用兩種前處理方式，對比優缺點，對本單位的檢測能力、檢測范圍、檢測速度的提升具有重要意義。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料 試驗所用羊肉、牛肉樣品購于農貿市場。本實驗所用試劑除特別注明者外均為分析純。乙腈為色譜純、甲酸為優級純。標準品：利福平、利福噴丁、利福布汀標準品純度均大于98%。

1.2 主要儀器設備 超高效液相色譜-質譜 聯 用 儀（I CLASS/XEVO TQD）、電 子 天 平（0.0001g）、高速冷凍離心機、水浴氮吹儀、固相萃取儀、數控超聲清洗器、渦旋混合儀。

2 試驗方法

2.1 樣品處理

2.1.1 樣品的制備 將牛肉、羊肉切塊，分別用絞肉機處理后分裝后于-20℃保存備用。

2.1.2 樣品處理 稱取5.0 g均質后的樣品置于50.0 mL具塞離心管中，用15.0 mL 1.0%冰乙酸溶液振蕩混勻，再加入15.0 mL乙腈，振蕩10 min。

混勻后加入QuEChERS提取包，振蕩混勻后10000 r/min，0～ 4℃離心 5 min，取 9.0 mL 上清液加入QuEChERS凈化管中，振蕩混勻后10000 r/min，0～4℃離心5 min，取5.0 mL上清液置于40℃下氮吹至0.4 mL，再加入1.0 mL乙腈溶解，過0.22μm濾膜后上機測定。

2.2 液相色譜條件 色譜柱：C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；柱溫：30℃ ；流速：0.3 mL/min；進樣量：10μL；梯度洗脫方式見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.3 質譜條件 檢測方式：多反應監測（MRM）模式；

電離模式：ESI+；

毛細管電壓：2.50 kV；

錐孔電壓：45 V；

源溫度：150℃；

脫溶劑氣溫度：500℃；

脫溶劑氣流量：650 L/Hr

其他質譜參數見表2。

表2 主要質譜參數

3 結果與分析

3.1 液相條件的優化

3.1.1 色譜柱的選擇 本研究采用Waters ACQUITY UPLC? C18 柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）來進行分離。3種抗結核藥物在C18柱上的分離情況根據色譜峰可以看出，3種化合物均可以出峰且能達到有效分離，利福布汀、利福平、利福噴汀保留時間分別為4.29、4.50、4.68 min。

3.1.2 流動相的選擇 試驗發現，當水相為水，利福噴汀、利福布汀難以出峰，且目標物的響應值都很低；當選擇0.2%甲酸水溶液為水相，甲醇為有機相時，利福噴汀、利福布汀會出現峰形疊加的情況；0.2%甲酸水溶液為水相，乙腈為有機相時，4種化合物的分離效果較好，峰形尖銳，與甲醇相比，乙腈的黏度更小，傳質阻抗小，更能溶解、洗脫目標化合物。綜上所述，以0.2%甲酸水溶液為水相、乙腈為有機相構成流動相體系，采用梯度洗脫方式可以使3種化合物取得較好的分離度。

3.2 質譜條件的優化 配制濃度為200 ng/mL的3種抗結核藥物混合標準溶液，用蠕動泵自動將混合標準溶液推入到ESI離子源中，首先進行全掃描，分別找出3個化合物的分子離子峰[M+H]+，然后對母離子逐級施加碰撞能量，使目標化合物破裂以獲得二級碎片離子，得到豐度較強的兩個子離子，分別作為定量和定性離子。繼續優化每一個目標物的MS/MS參數，最終得到優化后的母離子、子離子、碰撞能量等參數，3種抗結核藥物母離子的質量數分別為823.12、877.16、847.15。根據響應值判斷定量和定性離子，在實際樣品檢測中將二級離子的碎片信息與標準溶液進行比較，可以較好地找出目標化合物，避免假陽性情況的發生。

3.3 提取條件的選擇 試驗發現，3種抗結核藥物的提取回收率在酸性條件下明顯高于堿性和中性條件下。因此，選取實驗室常用的甲酸、乙酸，進一步研究酸的種類及濃度對3種抗結核藥物回收率的影響。試驗發現，添加甲酸后對回收率的提高略高于乙酸。結果表明，當甲酸濃度為0.1%時，3種抗結核藥物的回收率為60.8%～119.6%；當甲酸濃度為0.5%時，3種抗結核藥物的回收率為15.3%～82.2%。根據化合物的性質，試驗選用了不同提取溶劑對3種抗結核藥物進行提取。試驗結果如表3所示，當用乙酸乙酯和正己烷提取時，利福平的回收率不足50%；當用乙腈提取時，3種化合物的提取回收率為60.8%～119.6%，當用甲醇提取時，3種化合物的提取回收率為26.1%～81.5%。

表3 不同提取溶劑對3種抗結核藥物提取效果的影響 %

根據上述試驗結果確定用0.1%甲酸，乙腈為本試驗的提取液。

3.4 凈化條件的選擇

3.4.1 固相萃取小柱的選擇 根據化合物的性質，試驗比較了Oasis HLB、Oasis PRiME HLB固相萃取柱及QuEChERS法對利福平、利福噴汀和利福布汀的保留情況。3種固相萃取柱的比較結果見圖1，由圖1可見，經HLB萃取柱處理后，3種化合物回收率較其他兩種萃取柱低，波動范圍大，利福噴汀最為明顯；經PRiME HLB萃取柱處理后，利福平回收率較其他兩種萃取柱波動范圍大，穩定性較差，利福噴汀回收率偏低；經QuEChERS法處理后，3種化合物回收率相比較其他兩種萃取柱相對穩定，凈化效果較好。最終，本試驗的固相萃取柱確定為QuEChERS法。

圖1 3種固相萃取柱的比較

3.4.2 洗脫體積的優化 為優化洗脫溶液，試驗分別比較了乙腈、甲酸-甲醇、乙酸-甲醇作為洗脫溶液時3種抗結核藥物的過柱回收率。結果發現，在洗脫溶液中添加少量乙酸更有利于3種化合物的洗脫，進一步對乙酸濃度進行比較后，試驗最終確定洗脫溶液為甲醇（含0.5%乙酸）。依次用0.1%甲酸水溶液、水和50%甲醇水溶液對PRiMEHLB和HLB柱進行淋洗，研究甲醇（含0.5%乙酸）的體積對3種抗結核藥物的洗脫情況。試驗結果可以看出，甲醇（含0.5%乙酸）的洗脫體積為3.0 mL時，3種抗結核藥物基本全部洗脫，為確保3種抗結核藥物能全部洗脫，試驗最終確定洗脫體積為4.0 mL。

3.5 方法學驗證

3.5.1 標準曲線、檢出限和定量限 配制基質匹配曲線在本章建立的儀器條件下進行測定，用峰面積（y）分別對3種抗結核藥物的質量濃度（x）作回歸分析，如表4所示，利福平、利福噴汀和利福布汀分別在0.1～20.0μg/L范圍內呈良好線性，相關系數均大于0.99；以3倍和10倍信噪比分別為3種抗結核藥物的檢出限和定量限，利福平、利福噴丁和利福布汀的檢出限和定量限分別為0.30、0.31、0.22μg/kg 和 1.02、1.03、0.73μg/kg。

表4 3種抗結核藥物的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限

3.5.2 準確度和精密度 為驗證方法的準確度與精密度，試驗以空白牛肉、羊肉樣品為基質，通過添加低、中、高3個不同水平的混合標準溶液進行添加回收試驗，每個水平做6組平行，按1.3節進行樣品前處理后上機測定，結果見表5。

表5 不同基質中3 種抗結核藥物的加標回收率和相對標準偏差

3種目標化合物利福平、利福噴丁、利福布汀在牛肉的平均回收率分別為62.8%～109.2%、61.1%～115.4%、66.3%～105.9%，相對標準偏差（RSD，n=6）分別為4.0%～16.3%，4.3%%～14.3%，4.6%～10.0%，方法的精密度與準確度滿足相關標準要求。

3種目標化合物利福平、利福噴丁、利福布汀在羊肉的平均回收率分別介于62.1%～94.2%、61.6%～114.6%、61.2%～108.5%，相對標準偏差（RSD，n=6）分別為 9.2% ～ 15.8%，11.2% ～18.9%，3.0%～11.3%，方法的精密度與準確度滿足相關標準要求。

3.6 實際樣品的測定 購買新疆當地超市、農貿市場的羊肉、牛肉等畜產品共40份，待測樣品和質控樣品均按上述方法同時進行檢測。在實際樣品中，3種抗結核藥物均未檢出，但質控樣品中3種抗結核藥物的回收率良好，且保留時間與標準溶液的保留時間保持一致，說明該方法可用于實際樣品中3種抗結核藥物的殘留檢測。

4 結論

本研究主要以牛肉、羊肉為研究對象，建立超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法用于檢測3種抗結核藥物殘留。該方法具有操作容易、再現性好、靈敏度和選擇性高等優點。準確度和精密度滿足國標GB/T 27404-2008中對回收率和精密度的要求，說明該方法可用于動物組織中3種抗結核藥物的殘留檢測，可滿足相關食品部門和企業對牛羊肉中抗結核類藥物殘留的檢測，為嚴格質量提供必要的技術支持。